2. PÓSTERS
ÁREAS TEMÁTICAS
I. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL
II. BIOTECNOLOGÍA
III. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS
V. BIOFÍSICA
VI. NEUROCIENCIAS
VII. PARASITOLOGÍA MOLECULAR
VIII. INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA INFLAMACIÓN
IX. GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA
X. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ANIMAL
XI. RADICALES LIBRES

3. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL (1-8)
1) BÚSQUEDA DE SUSTRATOS DE LA DOS ÚNICAS FOSFATASAS DE
PROTEÍNAS EN TIROSINA DE Mycobacterium tuberculosis, PtpA y PtpB,
UTILIZANDO MUTANTES EN EL SITIO ACTIVO
M. Margenat1
, A.M. Labandera1
, M. Corbo 2
, C. Rivas2
, L. Rodríguez1
, A.M.
Ferreira3
y A. Villarino1
1
Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR);
2
Comisión Honoraria para la Lucha Antituberculosa y Enfermedades
Prevalentes, Departamento de Laboratorio, Centro de Referencia Nacional para
Micobacterias; 3
Instituto de Química Biológica, Cátedra de Inmunología,
Facultad de Ciencias (UDELAR)
Mycobacterium tuberculosis posee dos tirosín-fosfatasas, PtpA y PtpB, las
cuales están implicadas en la virulencia de la bacteria y sus sustratos podían
ser tanto proteínas de la bacteria como del macrófago infectado. El objetivo del
presente estudio es utilizar la metodología de “substrate trapping” para el
aislamiento de potenciales sustratos de PtpA y PtpB, basada en el uso de
mutantes puntuales en residuos conservados del sitio activo. Se obtuvieron los
mutantes PtpA-Cys11Ser, PtpA- Asp126Ala, PtpA-Arg17Ala y PtpB-Cys160Ser
y PtpB-Asp82Ala por mutagénesis sitio dirigida, los que están siendo
producidos en forma recombinante y purificadas por cromatografía de afinidad
y gel filtración. En paralelo, se obtuvieron extractos de proteínas de macrófagos
enriquecidos en fosfotirosin-proteínas a partir del cultivo de la línea
premonocítica humana THP1 diferenciados a macrófagos mediante incubación
con acetato de forbol miristato. Se prepararon tres extractos de proteínas de
macrófagos: 1) activados con lipopolisacáridos, 2) activados con
lipopolisacáridos e interferón gamma y 3) sin activar. Para la obtención de
extractos de M. tuberculosis se realizó el cultivo en medio mínimo Sauton y en
medio enriquecido (7H9). Utilizando como herramienta la Resonancia
Plasmónica de Superficie (SPR), hemos definido las características de la
interacción del mutante PtpA D126A y los extractos proteicos de macrófagos,
encontrándonos actualmente en condiciones de realizar el escalado de dicho
proceso. Para ello, utilizando la misma química usada en el ensayo de SPR, se
inmovilizó la proteína mutante PtpA D126A a la resina N-hidroxisuccinimida-
sefarosa, la cual se utilizará para el aislamiento de posibles sustratos de PtpA.

4. 2) ESTUDIO IN SILICO E IN VIVO ACERCA DE LAS FUNCIONES
MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS EISOSOMALES.
Agustina Olivera-Couto1,3
, Martín Graña2
, Laura Harispe1
y Pablo S.
Aguilar 1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de
Montevideo, Mataojo 2020, Montevideo 11400, Uruguay.
2
Unidad de Bioinformática, Institut Pasteur de Montevideo, Mataojo 2020,
Montevideo 11400, Uruguay.
3
aolivera@pasteur.edu.uy.
Los eisosomas son grandes ensambles macromoleculares de reciente
descubrimiento en varios hongos como ser la levadura del pan. Éstos se
localizan por debajo de la membrana plasmática de la célula, siendo centrales
para la definición de los dominios de membrana y limitando así el movimiento
lateral de una serie de lípidos y proteínas. Varios enfoques de biología celular y
genética nos han permitido mostrar que los eisosomas están conectados
funcionalmente con eventos celulares centrales, tales como la endocitosis y la
señalización intracelular. Además, datos bioquímicos señalan que por lo menos
diez proteínas diferentes componen los eisosomas en forma estable. Dos
proteínas parálogas, Pil1 y Lsp1, constituyen el núcleo del eisosoma, con 2.000-
5.000 ejemplares de proteína/eisosoma, mientras que el resto de las proteínas
varían desde decenas a cientos de copias/eisosoma. Datos cada vez más
refinados de la naturaleza y la dinámica de estos componentes se acompañan
con una falta de conocimiento respecto a sus funciones y mecanismos de acción
a nivel molecular. Hasta el momento no se habían descripto, para ninguna de
estas proteínas, dominios proteicos de función conocida. Para arrojar luz sobre
esta cuestión, se realizó un análisis bioinformático de alta sensibilidad, diseñado
para descubrir relaciones filogenéticas distantes y características estructurales de
eisosomas. Para varias proteínas, hemos logrado encontrar un importante
número de dominios estructurales, algunos de estos con potencial importancia en
cuanto a las funciones celulares de los eisosomas. Sorprendentemente,
encontramos en seis proteínas eisosomales la presencia de dominios potenciales
de tipo BAR, incluidas entre estas los componentes principales Pil1 y Lsp1.
Presentamos aquí un resumen de estos resultados bioinformáticos, así como las
validaciones experimentales, tanto in vitro como in vivo, que nos han permitido
corroborar la existencia de dichos dominios y caracterizarlos funcionalmente. En
general, nuestros resultados ofrecen un marco para abordar las características
mecanísticas moleculares de los eisosomas en relación a la organización de la
membrana plasmática.
Agradecimientos: Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII,
Uruguay) por la financiación.

5. 3) HACIA LA CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DEL
ANTÍGENO B DEL PARÁSITO Echinococcus granulosus
M. Folle1, 2
, V. Silva3
, A. Lima2
, C. Batthyány2
, B. Córsico3
y A.M. Ferreira1
1
Cátedra de Inmunología, Instituto de Higiene, Facultad de Química (UDELAR);
2
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Instituto Pasteur de
Montevideo; 3
Laboratorio de Interacciones Lípido-Proteína, INIBIOLP, Facultad
de Ciencias Médicas, La Plata, Argentina
El antígeno B (EgAgB) es una lipoproteína inmunogénica presente en el
metacestodo de E.granulosus (quiste hidático). Su componente lipídico es
heterogéneo, incluyendo una amplia variedad de lípidos neutros y fosfolípidos.
Su componente proteico (8 kDa) está codificado por una familia de genes
polimórficos específica de los cestodos que unen ligandos hidrofóbicos. Estos
genes se agrupan en 5 subfamilias -EgAgB8/1 a EgAgB8/5- cuya distribución
en el metacestodo y frecuencia en diferentes cepas del parásito se conoce
pobremente. Como los cestodos no son capaces de sintetizar colesterol,
fosfolípidos y ácidos grasos de novo, el EgAgB podría estar involucrado en la
adquisición de lípidos del hospedero. Como un primer paso para abordar esta
hipótesis buscamos identificar qué apolipoproteínas están presentes en
diferentes tejidos/compartimientos del quiste, qué lípidos unen y si hay
diferencias entre cepas distintas del parásito. Desarrollamos un nuevo método
de purificación del EgAgB basado en fraccionamiento por intercambio iónico y
ultracentrifugación en gradiente de KBr, y analizamos su composición por
electroforesis bidimensional y espectrometría de masa. Hasta el momento
observamos que el líquido hidático de quistes de la cepa G1 (bien adaptada al
hospedero ovino) contiene el EgAgB8/1, EgAgB8/2 y en menor proporción
EgAgB8/4. La mayoría de las isoformas EgAgB8/1 y EgAgB8/2 se enfocaron a
pH∼9, coincidiendo con sus pI teóricos, pero una proporción de éstas mostró pI
más ácidos, que se asocian a oligomerización. Resultados similares se
observaron con el EgAgB obtenido de la cepa G7 (adaptada al cerdo). Las
posibles modificaciones en las proteínas que explican esta observación están
bajo estudio.

6. 4) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA INHIBICIÓN DE LA
FOSFATASA EN TIROSINA DE Mycobacterium tuberculosis
POR EL ÁCIDO NITRO-OLEICO.
M. Gil1,*
, M. Margenat2,*
, R. Durán1
, C. Batthyány1
y A. Villarino2
.
1
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo
e IIBCE; 2
Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias
(UdelaR). *co-primer autor
La fosfatasa en tirosina de M. tuberculosis PtpB no posee homólogo eucariota y
actuaría tanto dentro de la bacteria como en las células infectadas, existiendo
evidencias que la supresión de su gen disminuye la supervivencia de la
bacteria en los macrófagos. In vitro, PtpB defosforila proteínas (en Ser/Thr y
Tyr) y fosfoinositoles. Su actividad reside en la capacidad de la Cys160 en
realizar el ataque nucleofílico al sustrato, la cual presenta un bajo pka
favorecido por la presencia de la His159 en el sitio activo. La regulación redox
mediante una modificación reversible de la cisteína catalítica podría ser un
mecanismo clave en la regulación de las fosfatasas eucariotas. Diferentes
especies reactivas de oxígeno y nitrógeno modulan la actividad de estas
fosfatasas y recientemente se demostró que lípidos oxidados son también
potentes inhibidores. Los ácidos grasos insaturados nitrados en un doble
enlace constituyen una familia de potentes electrófilos formados durante
situaciones de estrés oxidativo y que median acciones anti-inflamatorias en las
células a través de la modificación reversible de los residuos nucleofílicos Cys
e His de diferentes blancos moleculares, incluyendo enzimas y los receptores
PPAR . En el presente trabajo estudiamos la inhibición de la PtpB por el ácido
nitro-oleico (ácido 9- y 10-nitro-9-cis-octadecenoico; OA-NO2). Determinamos el
IC50 de la inhibición e identificamos el sitio de la reacción que media la
inhibición enzimática. Dada la ausencia de homólogos de estas fosfatasas en
eucariotas, la potente inhibición descrita presenta una interesante perspectiva
farmacológica para el diseño de inhibidores específicos de esta enzima.

7. 5) ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS VENENOS DE Bothropoides
pubescens y Rhinocerophis alternatus (Serpentes: Viperidae)
P. Berasain 1,2
, S. Carreira 3,4
, V. Morais 1
1
Departamento de Biotecnología, Instituto de Higiene, Fac. de Medicina
(UDELAR); 2
Unidad de Biología Parasitaria, Dto. de Biología Celular y
Molecular, Fac. de Ciencias (UDELAR); 3
Serpentario, Fac. de Ciencias-Fac. de
Medicina, Instituto de Higiene (UDELAR); 4
Laboratorio de Sistemática de
Vertebrados e Historia Natural, Instituto de Ecología y Ciencias Ambientales,
Fac. de Ciencias (UDELAR)
En promedio existen 65 accidentes por mordedura de serpientes en Uruguay
cada año. Todos son causados por dos serpientes incluidas en el género
Bothrops sp, ahora reconocidas como Rhinocerophis alternatus (crucera) y
Bothropoides pubescens (yara). El protocolo de tratamiento es idéntico para
ambas especies, usando el mismo suero antiofídico polivalente.
En este trabajo se comparan ambos venenos buscando diferencias de
composición y/o actividad biológica. Aunque los dos venenos presentan un
perfil de proteínas similar, se observa por densitometría diferencias en la
concentraciones relativas de las bandas para ambos componentes. El
componente principal de R. alternatus es una metaloproteinasa del tipo PIII que
representa aproximadamente el 30% de la masa total de proteínas del veneno.
Por otro lado, el componente principal del veneno de B. pubescens se
corresponde a una fosfolipasa A2 y representa el 35 % del veneno.
En lo que respecta a las actividades bioquímicas ambos venenos tienen
actividad coagulante y fibrinogenolitica similar, sin embargo B. pubescens
presenta actividad hemolítica indirecta mientras que en R. alternatus no se
detecta.
Es probable que la variación de las cantidades relativas de los venenos esté
relacionada con los hábitos de alimentación. Mientras R. aternatus se alimenta
exclusivamente de los mamíferos, B. pubescens tiene una amplia dieta que
incluye anfibios, reptiles, aves y mamíferos.

8. 6) AGREGACION DE LA alfa-SINUCLEINA: ROL DEL ESTRES
NITROXIDATIVO EN LA PATOGENESIS DE LA ENFERMEDAD DE
PARKINSON
C. Chavarría1
, L. Piacenza, G. Peluffo, W. Porcal2
, J.M. Souza1
1
Facultad de Medicina, Cátedra de Bioquímica, Centro de Investigaciones
Biomédicas en Radicales Libres (UDELAR). 2
Facultad de Ciencias, Instituto de
Química Biológica, Laboratorio de Química Orgánica (UDELAR).
La formación de agregados intracelulares de la proteína alfa-sinucleína (αS) en
neuronas dopaminérgicas está estrechamente vinculada con la patogénesis de
diversas enfermedades neurodegenerativas. A pesar de que el mecanismo
molecular que subyace el proceso de agregación de αS permanece incierto, se
cree que el estrés oxidativo y nitroxidativo constituyen un factor clave en la
pérdida neuronal asociada a estas patologías.
En este trabajo, analizamos la formación de agregados intracelulares de αS y
evaluamos el efecto del estrés nitroxidativo sobre el proceso de agregación
utilizando SIN-1 como agente nitrante. Trabajamos con una línea celular de
neuroblastoma humano SH-SY5Y establemente transfectada con una forma
mutante A53T de αS. Mediante la tinción de las células fijadas con tioflavina S
(ThS), sonda fluorescente que indica la presencia de placas amiloídes, y a
través del uso de anticuerpos anti-αS, detectamos los agregados de αS en
células. Además, la agregación de la proteína se cuantifica utilizando citometría
de flujo y se comparan los niveles de agregación en presencia y en ausencia
de un agente nitrante. Por otra parte, analizamos la toxicidad de las formas
agregadas para comprender mejor el proceso de agregación y su rol en la
patogénesis de las sinucleinopatías. Las preguntas que se intentan responder
son: 1) si los agregados son tóxicos, 2) cuál es la relación entre estrés
nitroxidativo y la agregación de la αS y 3) como se puede prevenir la toxicidad
mediada por la αS.

9. 7) MODULACIÓN REDOX DE LA PROTEÍNA QUINASA G DE
Mycobacterium tuberculosis
M. Gil1
, R. Durán1
, A. Denicola2
y C. Batthyány1
1
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo
e IIBCE; 2
Laboratorio Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias (UdelaR)
La fosforilación reversible de proteínas constituye la base de un lenguaje
universal utilizado para la transmisión de información en respuesta a estímulos.
En el caso Mycobacterium tuberculosis la señalización recae principalmente
sobre sistemas de fosforilación en serinas y treoninas típicamente eucariotas
(STPK). Una de estas STPK, PknG, es una quinasa citosólica que intervendría
en la supervivencia del bacilo dentro del macrófago. Además del dominio
catalítico quinasa, PknG posee un motivo rubredoxina (Fe(Cys)4) con Cys
esenciales que juegan un importante rol en la regulación redox de la actividad
enzimática. En este trabajo nos propusimos ahondar en la regulación de la
actividad quinasa de PknG por el dominio rubredoxina. En particular
estudiamos el efecto de lípidos nitrados, especies electrofílicas producidas
durante la activación del macrófago y que son capaces de modificar
específicamente residuos de Cys e His, sobre la actividad de PknG. Nuestros
resultados indican que el acido nitro-oleico es un potente inhibidor de la
enzima, y contrariamente a lo ya reportado para estos nitroalquenos, esta
inhibición es irreversible. Por espectrometría de masa demostramos que las
Cys localizadas en el dominio rubredoxina son el blanco preferencial de estos
inhibidores. La modificación covalente de estas cisteínas provoca la salida del
hierro del dominio rubredoxina. En base a estos resultados postulamos que el
mecanismo de acción de estos lípidos nitrados como inhibidores de esta
quinasa implica una reactividad diferente a la previamente reportada. Estos
datos plantean la interrogante sobre el potencial rol farmacológico de la
modificación de cisteínas del dominio rubredoxina en PknG.

10. 8) EFECTO DE LOS ÁCIDOS GRASOS EN LAS PROPIEDADES DEL TIOL
DE LA ALBÚMINA Y SU DERIVADO SULFÉNICO
M.J. Torres1
, L. Turell1,2
, B. Álvarez1
1
Laboratorios de Enzimología y 2
Fisicoquímica Biológica, Facultad de
Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay
El único tiol libre de la albúmina sérica humana (HSA-SH) es el más abundante
en plasma, pudiendo ser oxidado a un ácido sulfénico relativamente estable
(HSA-SOH). Cada mol de HSA circulante transporta normalmente 1-2 moles de
ácidos grasos (AG), aunque dicha relación puede alterarse bajo ciertos
estímulos. Continuando nuestro trabajo con albúmina deslipidada, se estudió el
efecto de la unión de ácidos grasos. La velocidad de reacción del tiol con el
ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) incrementó 2 y 6 veces en
presencia de 2 y 5 moles de AG por mol de HSA, respectivamente. HSA
deslipidada reaccionó con H2O2 a (1.45 ± 0.04) M-1
s-1
, y con ONOOH a (7.5 ±
0.3) x 103
M-1
s-1
, mientras que HSA-ácido esteárico (1:5) reaccionó el doble de
rápido, a (3.3 ± 0.8) M-1
s-1
y (14.7 ± 0.6) x 103
M-1
s-1
, respectivamente (37 °C,
pH 7.4). La exposición a H2O2 (2 mM, 5 min, 37 °C) rindió 0.15 moles de HSA-
SOH por mol de HSA deslipidada, ascendiendo a (0.29 ± 0.04) con ácido
esteárico (1:5). A su vez, la presencia de ácido esteárico (1:5) aumentó la
velocidad de reacción con tionitrobenzoato (TNB) de (115 ± 18) a (545 ± 42) M-
1
s-1
(25 ºC, pH 7.4), mientras su reactividad con diferentes tioles presentes en
plasma aumentó ~3 veces. Los aumentos en reactividad, más significativos con
moléculas grandes y cargadas (DTNB, TNB), que con pequeñas y neutras
(H2O2, ONOOH), pueden explicarse por un cambio conformacional en la
proteína, inducido por la unión de AG, que aumenta la exposición del tiol y
disminuye su pKa.

11. BIOTECNOLOGÍA (9-26)
9) BÚSQUEDA DE ACTIVIDAD INHIBITORIA DE TRIPSINA
EN EXTRACTOS DE PLANTAS AUTÓCTONAS
L. Macció1
, D. Vallés1
, A.M.B. Cantera1,2
1
Laboratorio de enzimas Hidrolíticas, IQB, Facultad de Ciencias (UDELAR);
2
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química
(UDELAR)
Las plantas tienen una variedad de inhibidores de proteasas serínicas, objeto
de numerosas investigaciones dado su posible papel como arsenal de defensa
de los vegetales. (Díaz, 2006)
En este grupo de inhibidores, se ha puesto énfasis en los inhibidores de
tripsina, de los que se conocen hasta el momento cuatro fuentes naturales (Fei
Fang, 2010).
En este trabajo se realizó la búsqueda de la capacidad inhibitoria de tripsina en
extractos de Baccharis trimera (carqueja) y Eugenia uniflora (pitanga).
Se prepararon extractos acuosos a 25 y 100ºC y etanólicos a 25 y 40ºC de
hojas de carqueja y frutos de pitanga con una relación 2:10 (w/v).
La capacidad inhibitoria se controló incubando tripsina con cada uno de los
extractos en estudio a distintos tiempos. La actividad remanente (%AR) se
determinó utilizando azocaseína como sustrato.
La capacidad inhibitoria de los extractos fue contrastada contra la producida
por PMSF (inhibidor inespecífico para las serín proteasas) en las mismas
condiciones de ensayo.Los extractos acuosos y etanólicos de carqueja en una
relación de 12mgvegetal/mLtripsina, mostraron, a los 5 minutos de incubación un
40% de inhibición de la actividad tríptica, no observándose cambios a tiempos
de incubación superiores (10, 20, 30 y 45 minutos).La incubación con extractos
acuosos de pitanga en una relación 12mgvegetal/mLtripsina , no presentaron acción
inhibitoria. Los extractos etanólicos, en cambio, mostraron un 80% de inhibición
de la actividad de la tripsina a los 5 minutos de incubación. El IC50
correspondiente al extracto etanólico de pitanga fue de 8mgvegetal/mLtripsina.

12. 10) CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DEL SISTEMA DE
TRANSGALACTOSILACIÓN CATALIZADO POR LA BETA-
GALACTOSIDASA DE ASPERGILLUS ORYZAE
A. Castilla1
, C. Giacomini1
, G. Irazoqui1
.
1
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química
En los últimos años se han reportado numerosas aplicaciones de alto impacto
para los galactósidos, en particular en el área de la salud. Entre ellas se
pueden destacar su uso en la producción de vacunas, en métodos de
diagnóstico, en la generación de prodrogas, como agente antitumorales, como
inhibidores de galectinas. Las glicosidasas son una excelente herramienta para
la síntesis enzimática de galactósidos. Entre las características de estas
enzimas se destaca su estéreoespecificidad que permite la generación de
glicósidos anomericamente puros en un solo paso de reacción, lo que hace de
ellas una interesante alternativa a la síntesis química. En particular la -
galactosidasa es capaz de catalizar procesos de transgalactosilación en el cual
la galactosa es transferida desde una molécula donadora de grupo galactosilo
a una molécula aceptora del mismo. Sin embargo para que el proceso sea
exitoso las condiciones deben ser optimizadas para cada sistema en particular.
En este trabajo se realizó una caracterización cinética del sistema de
transglicosilación catalizado por la -galactosidasa de Aspergillus oryzae,
utilizando orto-nitrofenil- -D-galactopiranósido (ONPG) como dador de grupo
galactosilo y diferentes moléculas aceptoras: etilenglicol, glicerol y etanolamina.
El comportamiento cinético del sistema se ajustó a un modelo de reacción con
dos sustratos siguiendo un mecanismo de sustitución enzimática. Además se
observó inhibición por sustrato, para los tres sustratos aceptores. Se
determinaron las constantes cinéticas para el dador (ONPG) en presencia de
diferentes concentraciones de cada uno de los aceptores y se están realizando
los experimentos complementarios para determinar las constantes de inhibición
de los mismos.

13. 11) EXPRESIÓN DE PROQUIMOSINA B BOVINA RECOMBINANTE EN
Escherichia coli BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR INDUCIBLE POR
ARABINOSA
F. Piriz1
, S. Castro-Sowinski1,2
, M. Marín1
1
Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UdelaR);
2
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE
La quimosina es una proteasa aspártica sintetizada por las células chief de la
mucosa gástrica del cuarto estómago de terneros lactantes. Hidroliza la kappa-
caseína, resultando en la coagulación de la leche en presencia de calcio. Esta
enzima es el componente esencial del “cuajo” para la elaboración de quesos,
ocupando el 80% del mercado mundial. Su alta demanda impulsa a la industria
a buscar fuentes alternativas.
El objetivo de este trabajo fue expresar en un sistema heterólogo la secuencia
de proquimosina B, por clonación direccional en el plásmido de expresión
pBAD18, abajo control del promotor inducible por arabinosa. Las células de
E.coli BL21 transformadas se indujeron por 5h con arabinosa y se lisaron por
sonicación y por prensa de French. Se utilizó el extracto celular como fuente de
proquimosina, y se activaron a pH2 y pH4 para la obtención de quimosina
(forma activa de la enzima). Se purificó parcialmente por precipitación salina
con (NH4)2SO4 al 80% de saturación, controlándose las fracciones por SDS-
PAGE. Se observó una banda correspondiente al tamaño esperado de la
quimosina comercial. La actividad enzimática (ensayo de coagulación de la
leche) se determinó antes y después de la activación. En las muestras
obtenidas por sonicación no se detectó actividad. En las fracciones obtenidas
por prensa de French, activadas y precipitadas, se detectó una actividad
específica de 15.4 h-1
g-1
(pH2) y 6.9 hs-1
g-1
(pH4).
Estos resultados nos alientan a seguir trabajando en la optimización de la
recuperación de la quimosina soluble y activa en este sistema heterólogo.
Agradecimientos: ANII

14. 12) OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE LAS CUTIVO PARA LA
PRODUCCIÓN DE POLISACÁRIDO CAPSULAR DE S. pneumoniae
serotipo 1
J. Checa, E.Texeira, F. Ferreira, N. Suárez.
Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Departamento de Desarrollo
Biotecnológico. Facultades de Medicina/Química. Instituto de Higiene, C.P
11600, Montevideo, Uruguay.
Streptococcus pneumoniae es agente causal de neumonía, meningitis, otitis
media y otras enfermedades infecciosas. Las cepas patógenas de la bacteria
producen una gruesa cápsula polisacarídica que constituye el principal factor
de virulencia y determinante antigénico. Este polisacárido es efectivo como
antígeno, generando inmunidad protectora y constituye la base de las
preparaciones vacunales actualmente en uso.
La producción y obtención de polisacáridos capsulares serotipo específicos
bien definidos es esencial para diagnóstico, preparación de vacunas así como
en investigación y desarrollo.
Tradicionalmente se han empleado medios complejos o semisintéticos para el
cultivo y crecimiento de S. pneumoniae, pero en el primer caso se requieren
procesos complejos de purificación del antígeno. Teniendo en cuenta estos
hechos y la conveniencia de utilización de medios definidos para la producción
de antígenos es necesaria la optimización de condiciones de cultivo que
permitan buenos rendimientos del proceso de producción y purificación.
En el presente trabajo se reportan los resultados del cultivo de S.pneumoniae
serotipo 1 y producción de antígeno capsular en condiciones definidas. En
particular se reporta la producción de biomasa, carbohidratos totales y
capsulares y pureza del producto.
Los resultados indican que el método de producción propuesto es una forma
eficiente de producción de éste antígeno en condiciones controladas.

15. 13) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA POBLACIÓN DEL
PATÓGENO PYRICULARIA ORIZAE EN URUGUAY
Chao,L.1
, Bonnecarrère,V.1
Ávila,S.2
1
Unidad de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria
INIA; 2
Estación Experimental Treinta y Tres, INIA.
El Tizón o Quemado del Arroz, provocado por el hongo patógeno Pyricularia
orizae es considerado una de las principales enfermedades de este cereal en el
mundo, a causa de su alta incidencia bajo condiciones favorables y las
pérdidas en el rendimiento que provoca. P.orizae es un hongo que puede
presentar una alta variabilidad genética, por lo que el estudio y caracterización
genética de la población del patógeno en Uruguay y su evolución temporal es
fundamental para el seguimiento de la enfermedad y la determinación de
mecanismos de control. Para ello se utilizaron dos metodologías moleculares,
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) que permite evaluar un gran
número de bases en el genoma del patógeno; y Pot-2 repPCR la cual amplifica
regiones mayores del ADN y detecta diferencias en el tamaño de los
fragmentos amplificadas. El objetivo de este estudio es encontrar linajes o
grupos genéticos que caractericen la diversidad genética del patógeno y
encontrar una tendencia en la patogenicidad entre linajes de P.orizae y
genotipos de arroz. Se analizaron aislamientos monospóricos de P.orizae
obtenidos en cultivos o viveros trampa, desde el año 1993 hasta 2010.
Mediante la técnica de AFLP se identificaron 3 grupos genéticos
significativamente diferentes, mientras que con la técnica de Pot-2 repPCR se
determinaron 4 grupos genéticos o linajes(A-D) con variaciones intra-linajes o
haplotipos. Dos de los linajes son mayoritarios (B y C) y afectan principalmente
a un cultivar cada uno de ellos. Debido a que esta técnica es más simple de
implementar y muy robusta, se considera la más adecuada para la evaluación
rutinaria de aislamientos del patógeno.

16. 14) EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD DE LA ACETOLACTATO
SINTASA (ALS) POR ACCION DEL ORTOSULFAMURON EN ARROCES
CLEARFIELD®
M .Diez Vignola1
, V. Bonnecarrère1
, N. Saldain2
.
1
Unidad de Biotecnología,INIA Las Brujas ; 2
Programa Arroz, INIA Treinta y
Tres
La cadena arrocera es netamente exportadora en Uruguay, requiriendo de una
producción competitiva y de alta calidad. En un 35% del área sembrada con
arroz existe infestación con arroz rojo o arroz maleza (AM). El AM pertenece a
la misma especie que el arroz cultivado (Oryza sativa L.) dificultando este
hecho el control selectivamente con herbicidas. Una respuesta comercial al
mismo es el Sistema de Producción de Arroz Clearfield®
. Ésta tecnología
combina el uso de imazapir + imazapic con variedades de arroz portadoras de
una mutación puntual en la enzima ALS que le otorga resistencia. Esta enzima
participa en la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada, por lo que su
inhibición provoca detención del crecimiento y posteriormente la muerte de las
especies susceptibles. Imazapir + imazapic, bispiribac, penoxulam,
metsulfuron pirazosulfuron (inhibidores de la ALS) cuando son aplicados de
manera frecuente seleccionan biotipos resistentes de las malezas que
controlan. Las poblaciones de malezas han sido sometidas a una fuerte
selección en contra de los individuos susceptibles a estos herbicidas en
nuestros arrozales. En este trabajo se validó una metodología para ensayos de
dosis-respuesta en tres materiales de arroz: INIA Olimar, CL146 y el híbrido
INOV CL frente a orthosulfamuron .El análisis de datos se realizó con el
programa estadístico R, ajustándose modelos no lineales específicos a las
curvas de dosis-respuesta obtenidas. Esta herramienta será muy útil para
detectar y monitorear la evolución de la resistencia en el AM y en el capín
(Echinochloa crus-galli (L.) Beauv) presentes en el cultivo.

17. 15) EXPRESIÓN DE proNGF HUMANO SOLUBLE EN Escherichia coli
M. J. Lista1
, A.de León1
, L. Barbeito1
1
Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo
El factor de crecimiento nervioso (NGF, del inglés nerve growth factor) es
miembro fundador y prototípico de las neurotrofinas, un grupo de factores
tróficos relacionados originalmente con el desarrollo, mantenimiento y
sobrevida del sistema nervioso central y periférico. El NGF es una proteína
secretoria de carácter básico cuya forma biológicamente activa consta de un
homodímero no covalente en solución. Traducido como una pre-pro-proteína
de 240 aminoácidos, cada monómero presenta tres puentes di-sulfuro
sumamente conservados donde dos enlaces di-sulfuro conforman una
estructura en forma de anillo que es atravesada por un tercer enlace dando
lugar al motivo conocido como nudo de cistinas. Dicha característica hace que
la expresión de la proteína en sistemas procariotas lleve a la producción de la
misma en forma insoluble. En este trabajo nos propusimos obtener proNGrh
soluble en un sistema de expresión procariota, conjugando así ventajas como
rapidez, simpleza y bajos costos de producción. Con ese propósito hemos
escogido la cepa de expresión E. coli SHuffle, la cual se caracteriza por
expresar en su citoplasma la enzima puente-disulfuro isomerasa DsbC cuya
función es isomerizar los puentes disulfuro incorrectamente formados a su
estado conformacional nativo. El uso de este sistema y la optimización de las
condiciones de expresión nos ha permitido la obtención de proNGF en forma
soluble y biológicamente activo.

18. 16) PREPARACION Y CARACTERIZACION DE FRACCIONES DE
SAPONINAS DE Quillaja brasiliensis CON REDUCIDA ACTIVIDAD
HEMOLITICA.
M. Mastrogiovanni, L. Quirici, S. Soulé, F. Ferreira
Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Dep. de Química Orgánica-
Instituto de Química Biológica, Facultades de Química y Ciencias, UDELAR.
La corteza de Quillaja saponaria Molina, árbol nativo de Chile, Bolivia y
Ecuador se emplea para la producción de metabolitos secundarios conocidos
como saponinas. Estos productos naturales son ampliamente utilizadas en la
industria y en la preparación de productos biológicos, en particular como
adyuvantes en la formulación de vacunas debido a su capacidad para
incrementar una respuesta específica a antígenos co-administrados. Sin
embargo, su utilización en vacunación se ve restringida debido a que se
presentan en el vegetal como mezclas complejas, algunos de cuyos
componentes pueden presentar efectos secundarios indeseables cuando son
administrados por vía parental. La formación de micelas nanoestructuradas,
llamadas ISCOMS, formuladas con estas saponinas, incrementa la actividad
adyuvante y reduce los efectos secundarios. Trabajos anteriores han
demostrado que fracciones de saponinas de otra especie del mismo género,
autóctona del sur de Brasil y Uruguay, Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.)
Mart., también son muy efectivas como adyuvantes y nuestro grupo ha logrado
demostrar su capacidad de formar ISCOMS. El objetivo de nuestro trabajo es
contribuir a la mejor caracterización estructural de estos productos, los cuales
son prometedores como herramientas para el diseño de vacunas más
efectivas. En el presente trabajo se presentan los resultados del
fraccionamiento bioguiado, en la búsqueda de compuestos y fracciones con
reducida actividad hemolítica de saponinas de Q. brasiliensis, así como la
caracterización química preliminar de las fracciones con menor actividad
hemolítica.

19. 17) CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS DE PROTEINAS
DEL LACTOSUERO CON PROTEASAS CISTEÍNICAS DE UNA PLANTA
AUTÓCTONA.
C. Villadóniga1
, A.M.B. Cantera1,2
1
Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad
de Ciencias (UDELAR); 2
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias,
Facultad de Química (UDELAR)
La influencia del pH y la temperatura en la estructura de las proteínas
mayoritarias del lactosuero, α-lactalbumina (α-La) y β-lactoglobulina (β-Lg),
está bien caracterizada y existe evidencia de que estos parámetros afectan su
susceptibilidad al ataque proteolítico. El efecto de las condiciones del ambiente
sobre el sustrato durante la proteólisis debe ser considerado, especialmente
cuando interesa liberar péptidos con características o funcionalidades
específicas.
En este trabajo se estudió el efecto del pH en la cinética de degradación
de las proteínas del lactosuero bovino con peptidasas cisteínicas de una planta
autóctona. Se trabajó con un extracto de frutos maduros de Bromelia
antiacantha Bertol. (EBA) previamente caracterizado. EBA presenta alta
actividad proteolítica a pH 5.0-9.0 y actividad máxima a 65 °C. Los resultados
electroforéticos y la cuantificación de aminos primarios mostraron que β-Lg se
degrada más rápidamente que α-la a pH 9.2 y 50 °C, llegando a valores de
grado de hidrólisis comparables (DH= 22 y 21 % respectivamente) a tiempo
final (120 min). Se determinaron los parámetros cinéticos a diferentes valores
de pH (4,2; 7,5 y 9,2). La afinidad de EBA para α-La es significativamente
mayor a pH 4,2 (Km=0,061 mM) mientras que β-Lg no mostró una velocidad de
degradación apreciable a este pH. El número de recambio para α-La es 2.5
veces mayor a pH 7,5 y 9,2 (Kcat= 7050 s-1
) que a pH 4,2. β-Lg a pH 7,5
presenta un numero de recambio semejante al de α-La mientras que a pH 9,2
es 2,5 veces mayor (Kcat= 18000 s-1
).

20. 18) PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LACASA
DE TRAMETES VILLOSA AISLADO DE EUCALYPTUS GLOBULUS
CULTIVADO EN URUGUAY
L. Gioia1,2
, C. Manta1
, P. Menéndez2
, K. Ovsejevi1
1
Cátedra de Bioquímica, DEPBIO; 2
Lab. de Biocatálisis y
Biotransformaciones, DQO. Facultad de Química (UDELAR)
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son oxidasas que pertenecen a la familia de
“proteínas azules de cobre”; utilizan oxígeno molecular como aceptor de
electrones, produciendo agua sin requerir costosos cofactores. La mayoría de
las lacasas son extracelulares producidas por hongos, especialmente por
“basidiomicetes de la podredumbre blanca de la madera”, que se caracterizan
por ser capaces de degradar la lignina de forma eficiente metabolizándola a
CO2 y H2O. Entre las posibles aplicaciones de las lacasas se destaca el
tratamiento de aguas residuales provenientes principalmente de las industrias
textil y papelera las cuales generan contaminación ambiental entre otros por su
contenido en polifenoles. La enzima actúa modificando la estructura química de
estos compuestos, convirtiéndolos en otros generalmente más inocuos para el
medio ambiente. Con la finalidad de optimizar dichas aplicaciones es necesario
comparar el comportamiento de la enzima con distintos grados de pureza. En
este trabajo se purificó una lacasa de Trametes villosa, cepa aislada de
Eucalyptus globulus cultivado en Uruguay. Se desarrolló un eficiente protocolo
de purificación involucrando las siguientes etapas: 1) Fraccionamiento salino,
2) Cromatografía hidrofóbica en Phenyl Sepharose®
con elución en columna,
3) Intercambio Iónico en batch con DEAE Sephadex®
y elución en columna por
cambio de fuerza iónica. El grado de pureza alcanzada fue evaluado mediante
Electroforesis PAGE-SDS, observándose una única banda proteica con
actividad enzimática en el eluido del Intercambio Iónico. Se determinaron las
condiciones de pH y temperatura óptima de catálisis y la estabilidad de la
enzima purificada.

21. 19) GENERACIÓN DE LEVADURAS CON PROPIEDADES INSECTICIDAS
L. Harispe 1
, H. Silva 2
, M. Mailhos 1
, E. Castiglioni 2
, C. Carlini 3
, P. Aguilar 1
1
Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay; 2
Estación Experimental Mario
Cassinoni, UDELAR, Uruguay ; 3
Centro de Biotecnología, UFR GS, Brasil.
Las semillas de la leguminosa Canavalia ensiformis producen una forma de la
enzima ureasa – llamada canatoxina - que posee actividad insecticida. Esta
actividad afecta a los insectos que poseen sistemas digestivos basados en
proteasas tipo catepsinas, incluyendo algunos de relevancia médica y agrícola
tales como Nezara viridula, Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus y
Triatoma infestans. La entomotoxicidad de la canatoxina se basa en la
presencia de un péptido interno de 10-15 kDa, denominado Jaburetox, que
puede ser producido in vitro mediante hidrólisis de la ureasa con catepsinas
obtenidas de insectos susceptibles. Este péptido, obtenido de forma
recombinante en E. coli, ha demostrado potente actividad insecticida cuando es
introducido en la dieta de varios insectos. Asimismo, se ha demostrado que la
administración oral o mediante inyección intraperitoneal de altas dosis de
Jaburetox-2Ec (10 mg/kg) a ratones y ratas, no produce la muerte ni síntomas
de toxicidad aguda. Hemos demostrado que S. cerevisiae es un modelo
biológico compatible con la expresión de este péptido. Una versión de
Jaburetox marcada en su extremo C-terminal con V5-6XHis (Jbx-2Ec) fue
clonada en distintos tipos de vectores de expresión y se determinaron los
niveles de proteína obtenidos. En base a estos resultados, nos proponemos
utilizar este organismo como modelo para el desarrollo de cepas de levaduras
que, a través de la producción de este péptido insecticida, presenten capacidad
entomotóxica sobre tres insectos blanco que afectan la producción regional de
soja (Piezodorus guildinii), maíz (Spodoptera frugiperda) y algodón (Dysdercus
peruvianus).

22. 20) PUESTO A PUNTO DE LA TÉCNICA DE PCR PARA EL
DIAGNÓSTICO DE Brucella abortus RB51 y S19.
M. Cattáneo1,2
, J. Bermúdez1,2
, F. Campos.3
1
Área de Bacteriología, Departamento de Microbiología,
Facultad de Veterinaria (UdelaR), Uruguay; 2
Laboratorios de Investigación y
Desarrollo. CCA. Laboratorios Santa Elena. Uruguay; 3
Facultad de Veterinaria
de Porto Alegre (UFRGS), Brasil.
La brucelosis bovina es una enfermedad infecto contagiosa de los bovinos
causada por Brucella abortus (B. abortus). Esta enfermedad es una zoonosis,
esta presente en nuestro país y es objeto de campaña oficial del Ministerio de
Ganadería. El género Brucella consiste en seis especies designadas en base a
su patogenecidad y tipo de húesped de preferencia: B. melitensis (cabras y
ovejas), B. abortus (vacas y bison), B. suis (cerdos), B. ovis (ovejas), B. canis
(perros) y B. neotomae (rata). Se han aislado cepas de Brucella en una gran
variedad de mamíferos marinos y se han propuesto dos nuevas especies: B.
ceti (cetaceos) y B. pinnipedialis (pinnípedos). Algunas de estas especies
incluyen varios biovares. Para diferenciar entre especies y biovares se llevan a
cabo 25 pruebas fenotípicas. Estas son muy costosas, se requiere de personal
capacitado y llevan tiempo. Para superar estos inconvenientes se ha
desarrollado la técnica de PCR multiplex para la tipificación de todas las
especies de Brucella, incluidas las cepas vacunales de B. abortus RB51 y S19.
El objetivo de este trabajo fue poner a punto la técnica de PCR multiplex para
la identificación de las cepas vacunales de B. abortus RB51 y S19. Se
estudiaron cepas pertenecientes a los ceparios del Departamento de
Microbiología y al Laboratorios Santa Elena. Se logro poner a punto la técnica
de PCR multiplex pudiendo diferenciar entre las cepas de B. abortus RB51 y
S19 estudiadas. Esta técnica es altamente específica, rápida y sencilla de
realizar. Se continuará trabajando para identificar por esta técnica las cepas de
Brucella ovis, canis y suis.

23. 21) MONITOREO INTRACELULAR DE CAMBIOS REDOX EN
TRIPANOSOMAS Y CÉLULAS HUÉSPEDES CON PROTEÍNAS
FLUORESCENTES REDOX-SENSIBLES
M. Curto1
, B. Manta1
, M. Laverriere2
, S. Astrada3
, M. Bollati3
, M. Comini1
1
Laboratorio de Biología Redox de Tripanosomas, Institut Pasteur de
Montevideo; 2
Universidad Nacional de San Martín, Buenos Aires;, 3
Unidad de
Biología Celular, Institut Pasteur de Montevideo
Las células están expuestas a especies reactivas de oxígeno y nitrógeno,
originadas como subproductos metabólicos o en el medio ambiente. Una
producción descontrolada y/o neutralización insuficiente de estos compuestos
es capaz de alterar el equilibrio redox celular causando daño en las
macromoléculas. Las células están equipadas con distintos sistemas que
controlan la homeostasis redox tiol-disulfuro a nivel intracelular. Por ejemplo, el
sistema tiorredoxina proporciona control cinético de la reducción de tioles
protéicos, mientras que el sistema del glutatión actúa como el principal
amortiguador redox. Los tripanosomátidos han desarrollado sistemas análogos
que dependen de una oxidorreductasa denominada triparredoxina y del
tripanotión (bis-glutationilespermidina), el principal tiol de bajo peso molecular
en estos parásitos.
Recientemente se han generado variantes de la proteína fluorescente verde
(roGFP2 y rxYFP) que permiten el análisis espacial y temporal de alteraciones
en el estado redox sin destruir la integridad celular. Los biosensores poseen
dos cisteínas en su superficie que transducen el estado tiol-disulfuro del pool
de glutatión en cambios cuantitativos en las propiedades del cromóforo
(intensidad de emisión a diferentes λ de excitación).
Nuestro objetivo es validar el empleo de estas herramientas para estudiar los
fenómenos redox durante los procesos de diferenciación celular, interacción
huésped-parásito y respuesta a estrés.
En estos estudios se utilizaron líneas celulares de T. cruzi y de células de
mamíferos, que expresan roGFP2 o rxYFP, las cuales fueron sometidas a
distintos estímulos. Los cambios redox fueron analizados mediante microscopía
confocal y análisis de citometría de flujo. Se mostrarán los resultados de estos
estudios preliminares.

24. 22) NUEVAS LÍNEAS REPORTERAS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD
BIOLÓGICA DE LOS INTERFERONES HUMANOS DE TIPO I
M. Bürgi1
, C. Prieto1
, M. Etcheverrigaray1
, R. Kratje1
, M. Oggero-Eberhardt
1
, M. Bollati-Fogolín2
1
Laboratorio de Cultivos Celulares - UNL, Santa Fe. Argentina; 2
UBC-IPMONT.
Montevideo. Uruguay
Dado el importante rol que cumplen los interferones (IFNs) en el sistema
inmune, sus potencias deben ser correctamente identificadas para ser
empleados como agentes biofarmacéuticos. Una metodología de uso corriente
es un ensayo antiviral pero presenta ciertas desventajas. Para evitar esto, se
desarrollaron 4 líneas celulares de diferente origen tisular (A549, Hela, Wish y
HEp-2) reporteras de la actividad de los IFNs humanos de tipo I (IFN-α e IFN-
β), utilizando el gen de la proteína de fluorescencia verde (eGFP) bajo el
control del promotor Mx-2 inducible por IFN.
El mencionado promotor respondió específica y cuantitativamente frente a la
adición de dichas citoquinas demostrando una buena correlación entre la
expresión de eGFP y las moléculas ensayadas. Por otro lado, no se observaron
diferencias significativas en los límites de detección al comparar las respuestas
de las distintas líneas celulares frente a los subtipos de IFN-α. Contrariamente,
se verificaron variaciones en tales límites al comparar la actividad de los
subtipos de IFN-β en las líneas HEp-2.
Por lo tanto, mediante la utilización de las líneas celulares apropiadas se podrá
llevar a cabo la estandarización de diferentes ensayos reporteros para medir la
potencia de los IFNs de tipo I de origen humano. En síntesis, las principales
ventajas de estos sistemas con respecto a los ya existentes son: rapidez,
sensibilidad, especificidad y seguridad, siendo útiles además, para evaluar el
modo en que los IFNs desarrollan su actividad en los diferentes tejidos
humanos o para el monitoreo de compuestos que interfieran en las vías de
señalización.

25. 23) CARACTERIZACION DE LA CAPACIDAD INVASIVA Y REPLICATIVA
DE CEPAS ATENUADAS DE SALMONELLA TYPHIMURIUM EN UN
MODELO DE CANCER DE MAMA
M. Masner1
, R. Gonzalez1
, N. Mazza1
, M. Moreno1
, P. Berasain1
, J.A.
Chabalgoity1
, M.G. Kramer1
1
Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Instituto de Higiene, Facultad de
Medicina (UDELAR)
Ante la necesidad de nuevas alternativas para combatir los tumores mamarios,
las bacterias del genero Salmonella presentan características ventajosas como
agentes terapéuticos. Ciertas cepas son capaces de localizarse y replicar
naturalmente dentro de tumores (y sus metastasis), pudiendo ejercer un efecto
antitumoral moderado, que combinado con otro tipo de terapias podría resultar
en un tratamiento efectivo para el control de estas neoplasias. En este trabajo
se emplearon dos cepas atenuadas de S. Typhimurium y se evaluó su
capacidad in vitro para invadir y replicar en células tumorales de cáncer
mamario. Además se estableció un modelo metastásico de cáncer mamario
murino donde se estudio el efecto de la administración de Salmonellas en la
evolución de los ratones portadores de tumores y su biodistribución tras
distintas vías de inoculación. Resultados preliminares indican que una de las
cepas estudiadas posee una alta capacidad para invadir y replicar in vitro en
distintas líneas tumorales de cáncer mamario. Estas bacterias inoculadas en
ratones también logran localizarse y replicar selectivamente en los ambientes
tumorales. Aunque el efecto intrínseco de estas Salmonellas en la sobrevida de
los ratones portadores de tumores es moderado, sus propiedades las perfilan
como una alternativa a explorar en el tratamiento contra el cáncer de mama.

26. 24) UTILIZACIÓN DE UN BIOSENSOR FLUORESCENTE REDOX SENSIBLE
EN UNA LÍNEA CELULAR DE IMPORTANCIA BIOTECNOLÓGICA
K. Perelmuter*1
, I. Tiscornia*1
, V. Porro1
, M. Comini2
, M. Bollati-Fogolín1
1
Unidad de Biología Celular; 2
Laboratorio de Biología Redox de Tripanosomas,
Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay.
*Ambos autores contribuyeron igualmente al trabajo
Funciones celulares tal como la replicación del ADN y la traducción de
proteínas son influenciadas por cambios en la homeostasis redox intracelular.
El monitoreo de dichos cambios redox en tiempo real y de manera no invasiva
permitiría diseñar estrategias de intervención específicas tendientes a optimizar
procesos de producción celular. Recientemente se han generado variantes de
la proteína fluorescente verde (roGFP2 y rxYFP) que permiten llevar a cabo
este tipo de análisis. En el presente trabajo empleamos la rxYFP para
monitorear la homeostasis redox in situ en una línea celular de importancia
biotecnológica. En primer lugar se generó una línea celular CHO.K1 productora
de GM-CSF que expresa de manera constitutiva la rxYFP. Los clones celulares
fueron seleccionados por enriquecimiento y posterior clonado mediante un
separador celular (MoFlo). Se comparó el crecimiento y metabolismo celular de
dos clones de referencia respecto de la línea celular original. Se determinó que
tanto la densidad celular, el consumo de glucosa, como la producción de
lactato y de GM-CSF no se vieron modificados por la introducción del sensor.
El análisis funcional del biosensor se realizó por citometría de flujo. Se
detectaron cambios en la intensidad de fluorescencia estímulo-dependientes
(peróxido de hidrógeno, agente reductor y compuesto pro-oxidante). Por otro
lado, se observó una disminución de la misma a partir del día 5 en cultivos tipo
batch, coincidente con el agotamiento de glucosa y la acumulación de lactato.
Experimentos en curso se orientan hacia la evaluación cuali- y cuantitativa de
estímulos fisiológicos.

27. 25) VECTORES LENTIVIRALES: HERRAMIENTAS EFECTIVAS PARA LA
TRANSDUCCIÓN CELULAR
M.L. Negro1,2
, S.G. Ahmed3
, R.J. Yáñez-Muñoz3
, P.J. Díaz-Amarilla4
, L.
Barbeito1
, H. Peluffo1,2
1
Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo.
2
Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad
de la República.
3
School of Biological Sciences, Royal Holloway, University of London, UK.
4
Laboratorio de Neurobiología Celular y Molecular, Instituto de Investigaciones
Biológicas Clemente Estable.
Los vectores retrovirales derivados de lentivirus han evolucionado en los
últimos años, siendo muy populares en su uso como mecanismos moleculares
especializados para la introducción de transgenes tanto en células replicativas
como postmitóticas. Los lentivectores derivados de HIV1 son capaces de
mediar la expresión in vivo a largo plazo en diversos órganos y tejidos. Cuando
son pseudotipados con la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G)
son capaces de transducir un amplio rango de células incluyendo neuronas
adultas y células gliales del sistema nervioso central. Estos vectores poseen la
capacidad de introducir secuencias de gran tamaño, de entre 10 y 12 kb,
siendo su expresión estable debido a la inserción preferencial en sitios activos
del genoma. Debido a la mutagénesis insertional que puede producirse, se han
desarrollado vectores lentivirales no integrativos. Aquí analizamos diferentes
protocolos de producción de vectores lentivirales de tercera generación con el
objetivo de aumentar el título obtenido. Analizamos el efecto de la cafeína y de
complementos lipídicos sobre el título obtenido. Además, analizamos la
eficiencia de estos vectores (ya sea integrativos como no integrativos) para
transducir diferentes tipos celulares del sistema nervioso tales como
motoneuronas y glias, así como su capacidad para generar líneas que
expresen establemente un transgén. En conclusión, hemos logrado producir
vectores lentivirales de tercera generación así como evaluar su eficiencia de
transducción en células en cultivo. Finalmente, logramos generar a partir de
una línea de células derivadas de astrocitos (Aba) una nueva línea de células
Aba que expresa establemente GFP.

28. 26) REGULACIÓN DE LA RUTA DE SÍNTESIS DE VALINA EN
Synechocystis sp. PCC 6803 PARA PRODUCCIÓN DE BIOBUTANOL DE
TERCERA GENERACIÓN.
A. Peri 1
, V. Amarelle, I. Loaces, C. Rodriguez, F. Noya.
1
Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbianas, IIBCE.
adperi@gmail.com
La producción de biocombustibles ha tomado relevancia en los últimos años,
basado en la necesidad de buscar alternativas a los combustibles derivados de
petróleo. Dentro de los alcoholes propuestos como sustitutos, se encuentra el
butanol, que presenta la ventaja de alcanzar un 95% de rendimiento que el
mismo volumen de gasolina.
Las cianobacterias son microorganismos atractivos para producción de
biocombustibles porque mezclan la facilidad de manipulación genética de los
organismos procariotas con la actividad fotosintética de las plantas. De todas
las especies, Synechocystis sp. PCC 6803 es la más caracterizada, y más
elegida en estudios de genética y metabolismo en cianobacterias.
El objetivo de este trabajo se basa en la transformación de Synechocystis sp.
PCC 6803, para producción de isobutanol, utilizando la vía de síntesis del
aminoácido Valina.
El 2-cetovalerato es el precursor final de valina, en un paso catalizado por la
enzima IlvE. Este cetoácido también puede ser convertido a butanal por una
descarboxilasa específica de cetoácidos, KivD, esta enzima es común
encontrarla en el genoma de Lactococcus lactis, organismo del cual se aisló.
La estrategia propuesta es la mutación del gen IlvE y posterior transformación
de Synechocystis sp. PCC 6803 con kivD, para de esta forma redirigir una vía
metabólica propia del microorganismo en una nueva vía de producción de
aldehído.
El aldehído producido puede ser convertido en butanol, por medio de
deshidrogenasas presentes en levaduras, obteniéndose de esta forma una
energía renovable de bajo costo, a partir de un microorganismo con mínimas
exigencias nutricionales.

29. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS
MICROORGANISMOS (27-48)
27) USO DE Pseudomonas fluorescens ααααC119 PARA MEJORAR LA
IMPLANTACIÓN DE LA ALFALFA
L. Braga1
, M.L. Yanes1
, N. Altier2
y A. Arias1
1
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable. Montevideo,
Uruguay; 2
Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria. Las Brujas,
Uruguay.
Las enfermedades de implantación son un factor limitante en el mantenimiento
de alfalfares productivos. El biocontrol mediante Pseudomonas fluorescentes
puede estimular el crecimiento de las plantas y/o disminuir el daño provocado
por patógenos favoreciendo la implantación del cultivo. La cepa nativa P.
fluorescens αC119, aislada de rizósfera de alfalfa, produce metabolitos
antifúngicos, protege la alfalfa contra el damping-off causado por Pythium
debaryanum y promueve su crecimiento en condiciones controladas.
Nuestros objetivos son evaluar el efecto biocontrolador y promotor del
crecimiento de la cepa αC119 sobre la alfalfa en condiciones de campo y el
impacto de su inoculación sobre la comunidad bacteriana de la rizósfera de
alfalfa.
Se realizó un ensayo de campo en el cual las semillas de alfalfa fueron co-
inoculadas con la cepa de P. fluorescens y rizobio comercial. Se evaluó
implantación a los 15, 60 y 100 días, y biomasa aérea a los 150 días post-
siembra. Se determinará la capacidad colonizadora de la raíz por la cepa
αC119, mediante recuentos en placa a partir de rizósfera de alfalfa colectada a
los 15, 60 y 100 días post siembra. El impacto sobre la comunidad bacteriana
de la raíz de alfalfa se determinará mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel
electrophoresis) del ADNr 16S amplificado por PCR a partir del ADN total
extraído de la rizósfera de plantas inoculadas con los dos tratamientos
mencionados. Estos resultados contribuirán al desarrollo de un producto
biotecnológico basado en una cepa nativa la cual aportará una herramienta
más para el desarrollo de sistemas agrícolas sustentables.

30. 28) CONSTRUCCIÓN DE UNA MUTANTE CARENTE DE
BACTERIOFERRITINA EN Sinorhizobium meliloti 1021.
D. Costa1
, V. Amarelle1
y E. Fabiano1
1
Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana. IIBCE-MEC. Av.Italia 3318
Montevideo. dcostaduarte@hotmail.com
Este trabajo tiene como objetivo estudiar el rol de la bacterioferritina (Bfr) en S.
meliloti 1021. El hierro es un elemento esencial en múltiples reacciones
bioquímicas incluyendo la fijación biológica del nitrógeno. Si bien, debe estar
presente en el interior celular, cuando éste se acumula en su forma libre
produce efectos tóxicos relacionados a la generación de especies reactivas del
oxígeno. Se ha propuesto que las ferritinas cumplen el papel de secuestrar
hierro intracelular y evitar el estrés oxidativo causado por un exceso de hierro,
aunque también podrían actuar como fuentes de hierro intracelular, cuando la
disponibilidad del metal es limitante. La Bfr es una proteína de almacenamiento
de hierro compuesta por 24 subunidades iguales o diferentes que forman una
cáscara esférica en cuyo interior se almacena hierro. Para lograr el objetivo
propuesto se realizó la construcción de mutantes carentes en bacterioferritina,
mediante una deleción in frame y mediante la inserción del cassette reportero
lacZGmR
. Además se construyó una doble mutante que carece además de
IRR, el regulador central de la homeostasis del hierro en S. meliloti 1021. La
verificación de las mutaciones obtenidas se realizará mediante Southern blot
con una sonda que hibrida en una región del gen bfr. Para conocer el fenotipo
de las mutantes se realizarán ensayos de expresión y curvas de crecimiento
bajo diferentes condiciones de cultivo (limitante y suficiente en hierro), además
de estudios in planta en los que se evaluará el rol de la Bfr en la simbiosis con
la planta hospedera alfalfa.

31. 29) CARACTERIZACION DE INTEGRONES EN AISLAMIENTOS DE Delfia
sp. RESISTENTES A METALES PESADOS Y ANTIBIOTICOS
F. Sueiro1, 2
, C. Martínez-Rosales1, 2
, M. Morel2
, M. Ubalde2
, C. Marquez3
, S.
Castro-Sowinski1, 2
1
Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2
Unidad de Micr obiología
Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable; 3
Cátedra
de Microbiología, Facultad de Química (UdelaR).
Los integrones son sistemas de capturar de casettes de genes exógenos por
recombinación sitio específica. Se caracterizan por codificar para una integrasa
(intI), un sitio de recombinación especifico (attI) y un promotor asociado que
dirige la expresión de los cassettes. En general contienen genes que codifican
para la resistencia a antibióticos y metales pesados (MP), y están implicados
en los procesos de transferencia horizontal de genes.
El objetivo de esta investigación fue caracterizar en tres aislamientos de Delftia
sp. (JD2, 3C y 6C): i) la resistencia a cromo [Cr(VI)] y plomo [Pb(II)]; ii) la
resistencia a antibióticos y; iii) la presencia de integrones (tipo I, II y III).
Los tres aislamientos fueron resistentes a ambos metales, determinado en
curvas de crecimiento en medio líquido conteniendo altas concentraciones de
estos MP. Además, fueron resistentes a antibióticos relacionados con la
inhibición de la síntesis de proteínas, pared celular y, síntesis de ADN y ARN
(determinado por MIC). Se comprobó la presencia de integrones tipo I por PCR
utilizando cebadores específicos, secuenciación de los fragmentos de
amplificación y análisis de secuencias en las bases de datos de la NCBI. Se
utilizó también cebadores dirigidos a las secuencias attI para el análisis de los
cassetes de genes integrados. Se encontró un bandeo similar para 3C y 6C
(ambos aislados de un suelo contaminado con Pb) y diferente para JD2
(aislado de un suelo contaminado con Cr). Actualmente estamos
caracterizando los fragmentos de amplificación de cassettes de 3C.
Los autores agradecen a PEDECIBA.

32. 30) CARACTERIZACION GENETICA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE
GUMBORO: ESTUDIOS COMPARATIVOS DEL GEN VP1
F. Ferrara1
, R. Pérez1
, G. Tomás1
, D. Hernández1
y M. Hernández1
1
Sección Genética Evolutiva, Departamento Biología Animal, Facultad de
Ciencias (UDELAR)
El Virus de Gumboro (IBDV) es el causante de una enfermedad que afecta
aves de corta edad produciendo importantes pérdidas económicas en la
industria avícola mundial. IBDV se replica en la bursa de Fabricius, donde
destruye linfocitos B inmaduros. Genera daño masivo e inmunodepresión,
causando infecciones secundarias por agentes oportunistas y una pobre
respuesta a vacunas. IBDV pertenece a la familia Birnaviridae, que se
caracteriza por estar compuesta por virus con genoma de ARN doble hebra
bisegmentado. El segmento mayor A codifica para una poliproteina que por
autoproteolisis genera las proteínas estructurales VP2 y VP3, la proteasa viral
VP4 y la proteína no estructural VP5. El segmento más pequeño B, codifica
para la proteína viral VP1, responsable de la replicación del genoma, síntesis
de ARNm e involucrada en la patogénesis. La región hipervariable de VP2, es
la más utilizada para clasificar IBDV en cepas clásicas, variantes e
hipervirulentas. Sin embargo, luego de la identificación de virus con
reordenamientos genómicos y el descubrimiento de que ambos segmentos
están involucrados en la patogénesis, es necesario el estudio de ambos
segmentos para proveer pistas sobre el origen, diversidad y epidemiologia de
IBDV. En este trabajo se logró la amplificación del gen vp1 en cepas de campo
clásicas e hipervirulentas. Con las secuencias obtenidas se desarrolló un
análisis comparativo con el fin de encontrar marcadores genéticos e
información que nos permita un mejor entendimiento de la incidencia del gen
vp1 en la biología de IBDV.

33. 31) ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE PARÁLOGO DEL GEN
TRANSPORTADOR DE UREA (UreA) DE Aspergillus nidulans
L. Carrau, M. Sanguinetti, A. Ramón
Sección Bioquímica, Departamento de Biología Celular y Molecular,
Facultad de Ciencias (UDELAR)
UreA ha sido identificada y caracterizada como un transportador de urea de
Aspergillus nidulans. A partir de la secuencia del ésta y haciendo una búsqueda
en el genoma de A. nidulans, se encontraron tres parálogos de este gen,
llamados ANID_02598.1, ANID_07373.1 y ANID_07557.1 que no transportan
urea. Es posible que los mismos codifiquen para transportadores de
especificidad desconocida.
El objetivo de este trabajo es determinar si estos parálogos se expresan o no
bajo determinadas condiciones cuidadosamente seleccionadas. Estas fueron:
condiciones de no represión, ausencia de nitrógeno y fase isotrópica de
crecimiento. El estudio de expresión se realizó mediante RT-PCR (transcripción
reversa–PCR) con primers específicos diseñados para amplificar los distintos
parálogos. De estos ensayos se obtuvieron resultados preliminares que
mostraron que ninguno de los tres genes se expresa, al menos bajo las
condiciones mencionadas.
Con la finalidad de profundizar en nuestro estudio, decidimos como siguiente
estrategia realizar una deleción del gen de uno de los tres parálogos, el
ANID_02598.1. Para esto se realizó una construcción génica mediante la
técnica de fusion-PCR, que contiene los extremos 5’ y 3’ del gen ANID_02598.1
y entre estos el gen pabaA como marcador auxotrófico. Esta construcción será
introducida en una cepa wt pabaA1, seleccionándose aquellas cepas capaces
de crecer en un medio carente de ácido p-aminobenzoico (paba). Para los
transformantes para los que se compruebe la deleción del gen, se realizarán
ensayos de crecimiento en placa utilizando como fuente de nitrógeno distintos
compuestos nitrogenados, procurando así determinar los posibles sustratos de
ANID_02598.1.

34. 32) CARACTERIZACIÓN DE LA GLUTARREDOXINA MONOTIÓLICA 1 DE
Trypanosoma cruzi.
A. L. Fleitas1
, B. Manta1
, A. Medeiros1
, G. Ferrer Sueta2
, N. Dirdjaja3
, M. A.
Comini1
.
1.
Laboratorio de Biología redox de tripanosomas, Institut Pasteur de
Montevideo, Uruguay; 2.
Facultad de Ciencias, Universidad de la República,
Uruguay; 3.
Centro de Bioquímica, Universidad de Heidelberg, Alemania.
El tratamiento de la tripanosomiasis americana es limitado dada la inexistencia
de vacunas y a que la quimioterapia actual resulta tóxica e ineficaz. El estudio
de rutas metabólicas relevantes para la infectividad y patogénesis puede
contribuir a mejorar esta situación. En este sentido, hemos demostrado que la
glutaredoxina monotiólica 1 de T.brucei (1-C-Grx1) es una proteína mitocondrial
capaz de coordinar centros ferro-sulfurados (ISC) utilizando la cisteína de su
sitio activo putativo y tioles de bajo peso molecular (RSH). Esta proteína
probablemente desempeña un rol conservado en el ensamblaje de ISCs o en la
entrega de estos cofactores a sus aceptores, siendo importante en el
metabolismo del hierro e, indirectamente, en la homeostasis redox. Su función
es fundamental para la diferenciación del parásito y la supervivencia en el
huésped mamífero presentando asimismo divergencias estructurales y
bioquímicas que la posicionan como posible blanco terapéutico. El objetivo de
nuestro trabajo es estudiar la proteína homóloga de T.cruzi, procurando revelar
su papel fisiológico. La secuencia codificante de la 1-C-Grx1 fue aislada de
ADN genómico de T.cruzi cepa Tulahen. La forma recombinante de la proteína
sobreexpresada en E.coli fue purificada y caracterizada bioquímicamente
mediante cromatografía de exclusión molecular, dispersión dinámica de luz y
técnicas espectroscópicas. Al igual que Tb 1-C-Grx1, Tc 1-C-Grx1 es una
proteína dimérica que une ISCs sin cambiar su estructura cuaternaria. La
eliminación de una extensión N-terminal sólo conservada entre 1-C-Grx1 de
tripanosomátidos convirtió la apo-proteína en una especie monomérica. Los
resultados serán discutidos considerando lo sabido sobre estas glutarredoxias
al momento.

35. 33) OPTIMIZACIÓN DE RT-PCR PARA LA CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR DEL VIRUS DE INFLUENZA CIRCULANTE EN URUGUAY
DURANTE LA TEMPORADA INVERNAL 2011
M. Sóñora1
, V. Comas1
, N. Goñi1
, G Moratorio1
, M. Cappetta2
, R. Uriarte2
,
S. Boschi2
, J. Cristina1
, P. Moreno1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias (UDELAR); 2
Laboratorio de Biología Molecular,
Asociación Española Primera de Socorros Mutuos.
La sorpresiva aparición de una variante del virus influenza A/H1N1 en abril del
2009 condujo a declarar la inminente llegada de la primer pandemia del siglo
XXI y con esto la urgencia por resolver dicho problema. Este trabajo busca
mediante el análisis filogenético de las proteínas hemaglutinina (HA) y
neuraminidasa (NA) establecer relaciones genéticas y antigénicas entre
estirpes virales circulantes en nuestro país durante la temporada invernal 2011.
Para ello se realizarán análisis comparativos contra las estirpes circulantes en
la región para esta misma temporada, así como con las estirpes incluidas en la
vacuna recomendada por la OMS. Con este fin se planteó la necesidad de
desarrollar y optimizar una RT-PCR que permita la amplificación de los genes
NA y HA de los virus de Influenza A (VIA) H1N1, H3N2 y del virus de Influenza
B. Mediante esta metodología podremos secuenciar las estirpes de VIA
circulantes en Uruguay en dicha temporada. Una vez optimizada esta técnica
se realizará el estudio de exudados nasales de pacientes uruguayos con
síntomas clínicos de influenza, provenientes de la Asociación Española Primera
de Socorros Mutuos (AESPM). A través del análisis filogenético de las
secuencias obtenidas, y las reportadas en el banco de datos, se determinarán
las relaciones filogenéticas de interés. La vigilancia mundial de la Influenza es
esencial para brindar información sobre cepas circulantes, ya que su rápida
identificación durante la temporada invernal provee valiosa información a las
autoridades de salud pública y posibilita una vacunación apropiada y
tratamiento profiláctico para grupos de alto riesgo.

36. 34) PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN PÉPTIDO ANTIFÚNGICO
PRODUCIDO POR LA CEPA Pseudomonas fluorescens CFBP2392
N. Riera, 1
, N. Bajsa 1,2
, A. Arias1
1
Laboratorio de Ecología Microbiana, IIBCE; 2
Sección Bioquímica, Facultad de
Ciencias (UDELAR)
El control biológico es una práctica agrícola que se basa en introducir
microorganismos vivos para controlar patógenos que afectan el crecimiento
vegetal. La cepa Pseudomonas fluorescens CFBP2392 tiene actividad como
agente de biocontrol suprimiendo la enfermedad “root rot” inducida
por Rhizoctonia solani en tomate. Estudios anteriores muestran que esta
bacteria no produce ninguno de los antibióticos más caracterizados dentro del
género Pseudomonas. El objetivo de este trabajo es purificar y caracterizar un
nuevo metabolito con actividad antifúngica producido por esta cepa. Se eligió
un organismo blanco para comprobar la actividad antagonista del metabolito
mediante ensayos de antagonismo in vitro de Pseudomonas fluorescens contra
diferentes microorganismos. La mayor actividad inhibitoria se observó contra un
aislamiento de Rhizoctonia solani AG3. Se seleccionó un medio de cultivo
apropiado para maximizar la síntesis del compuesto, comparando la actividad
inhibitoria en varios medios sintéticos. Se comprobó una mayor actividad en un
medio mínimo para Pseudomonas con casaminoácidos y triptófano. Se evaluó
un protocolo para la purificación del compuesto. Mediante extracción con
acetato de etilo y cromatografía en capa fina (TLC) se identificó una fracción
con actividad antifúngica. Actualmente se está ajustando su separación por
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para lograr una pureza
adecuada para su análisis espectroscópico. Hoy en día se hace
particularmente importante la identificación y el registro de nuevos antibióticos
tanto para la industria agrícola como clínica. Estos compuestos apuntan a una
mejora en el sector ambiental ya que pueden ser utilizados como una
alternativa al uso de fungicidas químicos.

37. 35) PRIMER ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DEL GENOMA COMPLETO
DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA OBTENIDO A PARTIR DE UN
LINFOSARCOMA
S. Fischer 1, 2
, S. Bianchi1, 3
, G. Rama1
, L. Tome1, 4, 5
, G. Obal1, 5
, F.
Carrión1
, J. Cristina1
, O. Pritsch1, 5
, G. Moratorio1, 2
1
Unidad de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay; 2
Laboratorio de Virología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la
República, Uruguay; 3
Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina,
Universidad de la República, Uruguay; 4
Sección Virología, Facultad de
Ciencias, Universidad de la República, Uruguay; 5
Departamento de
Inmunobiología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay.
El Virus de la Leucosis Bovina (VLB), pertenece a la familia Retroviridae y al
género Deltaretrovirus. Dicho virus es responsable de la enfermedad conocida
como Leucosis Bovina Enzootica (LBE). Ésta se manifiesta en tres formas
clínicas posibles: a) Asintomática; b) Linfocitosis Persistente (LP), con elevados
niveles de células B no malignas y c) Linfosarcoma. Su estudio es de gran
relevancia para los sectores agropecuarios y agroindustriales del Uruguay ya
que compromete mercados importantes de exportación. Además, la
inexistencia de programas de control de la enfermedad ha dado lugar a una
elevada prevalencia de VLB en la actualidad. El análisis y estudio del genoma
viral de VLB es de fundamental importancia para entender la patogenia de la
enfermedad causada por este agente etiológico. Actualmente existe escasa
información disponible sobre genomas completos de VLB, y de estos, ninguno
ha sido reportado a partir de la manifestación clínica linfosarcoma. Para
contribuir al conocimiento de la Leucosis Bovina, el presente trabajo tiene como
objetivo principal la optimización y puesta a punto de las técnicas moleculares,
que permitan la amplificación y clonación del genoma completo del virus
obtenido a partir de un linfosarcoma. Posteriormente, se realizó el
secuenciamiento completo y diversos análisis bioinformáticos, como
alineamientos de las secuencias aminoacídicas de las proteínas virales,
estudios de análisis de estructuras secundarias a lo largo del genoma viral y
de regiones no codificantes del mismo. Con el presente trabajo, intentamos
también acercarnos a responder cuánto puede influir la genética viral en la
manifestación clínica tumoral de la enfermedad.

38. 36) DESARROLLO DE UNA ESTRATEGIA PARA EL ANALISIS DE
GENOMAS COMPLETOS DEL VIRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDEMICO
CIRCULANTE EN URUGUAY EN EL AÑO 2009
V.Comas1
, M.Soñora1
, P.Moreno1, 3
, G.Moratorio1, 2
, J.Cristina1
, N.Goñi1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares
(CIN), Facultad de Ciencias (UDELAR); 2
Unidad de Biofísica de Proteínas,
Instituto Pasteur de Montevideo; 3
Unidad de Proteínas Recombinantes, Instituto
Pasteur de Montevideo.
El virus de la influenza A (VIA) pertenece a la familia Orthomyxoviridae y
contiene un genoma de ARN constituido por ocho segmentos. Dentro de los
VIA existen diferentes subtipos que se clasifican de acuerdo a las
glicoproteínas de superficie: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA).
Cambios frecuentes en estas proteínas constituyen la base de las epidemias y
pandemias. En marzo 2009 surgió un nuevo VIA pandémico H1N1 de origen
porcino. Su genoma es producto de una combinación de segmentos
provenientes de cerdos y aves de Norteamérica, de humanos y de cerdos de
Eurasia. Los objetivos de este trabajo son desarrollar un método para obtener
genomas completos de estas cepas y determinar el grado de variabilidad de las
mismas. Actualmente hemos optimizado los genes HA, NA, matriz (M) y no
estructural (NS) de tres muestras de VIA subtipo H1N1 pandémicas que
circularon en 2009 en Uruguay. Para realizar este objetivo se amplificó la carga
viral de estas muestras mediante el pasaje por cultivos celulares y
posteriormente se realizó la extracción de RNA y la RT-PCR para estos 4
genes utilizando cebadores previamente diseñados. Con las secuencias
obtenidas se identificará el modelo evolutivo que mejor describa nuestros datos
y construirá árboles filogenéticos. El conocimiento del genoma completo de VIA
nos proporcionará información de los procesos epidemiológicos, de qué
manera ocurren, migran, co-circulan y se reordenan cepas circulantes
permitiendo la formulación de mejores vacunas para nuestro país y la región,
siendo las cepas H1N1 pandémicas posibles futuras cepas vacunales.

39. 37) PREDICCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE EXCRECIÓN EN RESPUESTA
A LA TOXICIDAD POR AMONIO EN S. cerevisiae
M. San Román1
, M. Ponce de León1
, H. Cancela2
y L. Acerenza1
1
Laboratorio de Biología de Sistemas, Facultad de Ciencias, Universidad de la
República, msanroman@fcien.edu.uy, mponce@fcien.edu.uy,
aceren@fcien.edu.uy; 2
Instituto de Computación, Facultad de Ingeniería,
Universidad de la República,
cancela@fing.edu.uy
Una herramienta fundamental de la Biología de Sistemas para el estudio del
funcionamiento celular son las redes metabólicas reconstruidas a escala
genómica. Estas redes contienen la lista de todas las reacciones que pueden
tener lugar en un organismo particular, en diferentes condiciones.
La red metabólica se puede emplear, por ejemplo, para calcular como
responde la tasa de crecimiento y el patrón de productos de excreción a la
variación en la composición del medio. Distintas estrategias de modelización,
como el Análisis de Balance de Flujo (FBA) o la Minimización de los Ajustes
Metabólicos (MOMA), son empleados con este fin. FBA consiste en maximizar
la tasa de crecimiento, sujeto a un conjunto de restricciones que aseguran una
distribución de flujos estacionarios y acotados. MOMA, en lugar de maximizar
crecimiento, minimiza la distancia a un punto de referencia, sujeto al mismo
conjunto de restricciones que FBA.
El amonio ha sido reportado como inhibidor del crecimiento celular. Aquí,
empleamos FBA y MOMA para calcular como responde la red de S. cerevisiae
a cantidades crecientes de amonio en el medio. Ambos procedimientos
predicen correctamente que, en el rango tóxico, la tasa de crecimiento decrece
con el aumento de la concentración de amonio. El nitrógeno sobrante se
elimina excretando compuestos nitrogenados, principalmente aminoácidos.
FBA predice la excreción de uno y MOMA de 15 aminoácidos. De los 14
aminoácidos cuya excreción se ha medido experimentalmente, 10 coinciden
con los predichos por MOMA. La excreción de aminoácidos parecería ser el
principal mecanismo de detoxificación usado por la levadura.

40. 38) Expresión diferencial de macromoléculas a baja temperatura en la
bacteria antártica Pseudomonas sp. AU10
C. Martínez Rosales1,2
, N. Fullana1
, M. Señorale1
, M. Morel2
, M. Dardanelli3
,
y S. -Sowinski1,2
.
1
Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR, Igual 4225, Montevideo-
Uruguay; 2
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE, Av. Italia 3318,
Montevideo-Uruguay; 3
Departamento de Biología Molecular, Universidad
Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina
s.castro.sow@gmail.com
Las bajas temperaturas imponen un desafío al desarrollo de la vida, ya que
afectan varios procesos fisiológicos celulares, llegando a disminuir el
metabolismo general, e incluso a provocar daños en la célula debidos a la
formación de hielo intracelular. La vida en ese tipo de ambientes requiere que
los microorganismos diferentes estrategias fisiológicas, que involucran la
producción de ciertas macromoléculas dependiendo de la temperatura
ambiental. Estas macromoléculas cumplen roles importantes cuando las
bacterias crecen a bajas temperaturas, y nos acercan a comprender los
mecanismos de adaptación bacteriana al frío.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la producción de macromoléculas a dos
temperaturas, y así contribuir al conocimiento general de los mecanismos
involucrados en la adaptación al frío en bacterias. Describimos la identificación
de proteínas intracelulares que se expresan diferencialmente a bajas
temperaturas, y la caracterización de lípidos y exopolisacáridos (EPS)
producidos a 4ºC y 30ºC, en la bacteria antártica Pseudomonas sp. AU10.
La composición de lípidos y EPS se analizó mediante CG-EM. La expresión de
proteínas se estudió mediante electroforesis 2D de dos fracciones celulares
(membrana externa/periplasma, y membrana interna/citoplasma), y se
identificaron las proteínas expresadas diferencialmente a 4ºC mediante
MALDI/ToF.
Se detectaron diferencias en EPS y lípidos, sugiriendo que estas
macromoléculas participan de alguna manera en la adaptación al frío,
probablemente como crioprotectores. Además, varias proteínas relacionadas a
los procesos de transcripción, traducción, metabolismo, y transporte de solutos
se expresaron diferencialmente a 4ºC.
Agradecemos el apoyo financiero de ANII, PEDECIBA, y el apoyo logístico del
IAU.

41. 39) DETECCION DE METALO-β-LACTAMASAS EN TRES CENTROS
ASISTENCIALES DE MONTEVIDEO
Bado I1
- Gutierrez C2
, Rodriguez M3
, Batista M1,3
, García V1
, Cordeiro N1
,
Robino L1
, Valeta I3
, Palacio R2
,Seija V4
,Vignoli R1
.
1
Instituto de Higiene, Facultad de Medicina (UDELAR); 2
Hospital de
Clínicas, Facultad de Medicina (UDELAR); 3
C.U.D.A.M; 4
Hospital Pasteur;
Antecedentes: Uno de los principales mecanismos de resistencia a los β-
lactámicos, antibióticos muy utilizados a nivel clínico, es la producción de β-
lactamasas, enzimas capaces de hidrolizarlos. Estas pueden clasificarse en: A,
B, C y D, siendo las de clase B las únicas que contienen en su centro activo
2Zn+2
(metalo-β-lactamasas). Su importancia, radica en su acción sobre los
carbapenems, antibióticos de amplio espectro, utilizados sobre
microorganismos altamente resistentes. Objetivos: Detectar la presencia de
metalo-β-lactamasas en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa
provenientes de tres centros hospitalarios. Metodología: a 113 aislamientos
clínicos de P. aeruginosa, se les realizó test de screening para metalo-β-
lactamasas, mediante disco difusión, con discos de EDTA, imipenem y
meropenem. A los microorganismos positivos, se les hizo PCR para la
detección de metalo-β-lactamasas, confirmando los resultados mediante
secuenciación. Resultados: cuatro aislamientos provenientes de los tres
centros fueron positivos para el test de sinergia, tres de ellos correspondieron a
blaVIM-2, y eran positivos para integrones de clase 1; mientras que el cuarto
caso continúa siendo estudiado. Conclusión: Este es el primer reporte de blaVIM-
2 en distintos centros hospitalarios, sin embargo, se trataría de aislamientos
esporádicos. Todavía no se ha podido determinar que tipo de enzima posee el
cuarto caso, claramente poseedor de una metalo-β-enzima por el test de
sinergia. Las carbapenemasas se encuentran ampliamente distribuidas a nivel
mundial, llegando algunas a ser endémicas en el ambiente hospitalario,
dificultando su control una vez instaladas. Es fundamental llevar a cabo
sistemas de vigilancia para evitar su diseminación.

42. 40) PRESENCIA DE INTEGRONES EN BACTERIAS AISLADAS DE
SUELOS DE LA PENÍNSULA FILDES, ISLA REY JORGE (ANTÁRTIDA
MARÍTIMA)
V. Antelo1
, A.M. Guérout2
, S.Batista1
, D. Mazel2
1
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE; 2
Unidad de Plasticidad del
Genoma Bacteriano, Departamento de Genomas y Genética, Instituto Pasteur
de París.
La transferencia horizontal de genes es reconocida como un mecanismo de
distribución generalizada de resistencia a antibióticos en bacterias. Los
microorganismos aislados de ambientes ”extremos” han sido poco estudiados
en lo que refiere a la presencia de genes de resistencia y su incorporación en
elementos denominados integrones. El objetivo del trabajo es el estudio de
integrones y elementos genéticos asociados, en una colección de bacterias
resistentes a distintos antibióticos obtenidas a partir de muestras colectadas en
la Isla Rey Jorge. Las muestras fueron tomadas en distintos sitios de la
Península Fildes, durante las campañas antárticas estivales del 2008 y 2010.
Las muestras suspendidas en buffer fueron utilizadas para inocular frascos con
medio LB, que se incubaron a 5°C y 22°C con agitaci ón. Se obtuvo una
colección de 200 aislamientos presuntamente puros y se determinó el perfil de
resistencia antibiótica para cada uno de ellos. Al usar como templado el ADN
genómico de los aislamientos resistentes a trimetoprim (Tmr) se logró
amplificar por PCR un producto del tamaño esperado usando cebadores para
el gen intI1 (integrasa1). A partir de seis aislamientos (Tmr) se purificó un
plásmido y se analizó la secuencia de parte del gen intI1 y dfrA14
(dihidrofolato-reductasa). El análisis de secuencia del gen 16S ADNr indicó que
estos aislamiento (Tmr) pertenecen al género Enterobacter (99%). Seis de los
aislamientos poseen plásmidos conteniendo genes intI1 y dfrA14 altamente
conservados, siendo su organización genética similar a la del plásmido
pKOX105 de Klebsiella oxytoca.
Financiamiento: IAU, ANII, PEDECIBA, AMSUD-Pasteur

43. 41) DETECCIÓN DE CTX-M EN NIÑOS QUE SE ASISTEN EN EL CENTRO
HOSPITALARIO PEREIRA ROSSELL
V.García 1
, I.Bado1
, I.Mota1,2
, L.Robino1
, N.Cordeiro1
, A.Varela2
,
G.Algorta1,2
, R.Vignoli1
1
Depto. de Bacteriología y Virología, Facultad de Medicina (UDELAR); 2
Centro
Hospitalario Pereira Rossell (CHPR)
Introducción
La resistencia antimicrobiana en enterobacterias es un fenómeno creciente a
nivel hospitalario, siendo oxiiminocefalosporinas, aminoglucósidos, y
fluoroquinolonas los antibióticos más utilizados. Los principales mecanismos
transferibles de resistencia involucrados son: la producción de β-lactamasas de
espectro extendido (BLEE); la enzima Aac(6’)Ib; las proteínas Qnr y la enzima
Aac(6’)Ib-cr, respectivamente.
Objetivos
Conocer la proporción de CTX-M y su asociación con mecanismos transferibles
de resistencia a quinolonas (PMQR) en enterobacterias aisladas en el
Laboratorio del Hospital Pediátrico Centro Hospitalario Pereira Rossell (HP-
CHPR).
Materiales y Métodos
Se incluyeron todos los aislamientos de enterobacterias obtenidos en el HP-
CHPR entre el 1/1-30/12 de 2010. El tamizaje para la detección de BLEE fue
realizado según CLSI. A las cepas con sospecha de BLEE se les realizó PCR
para: detección de blaCTX-M, aac(6´)Ib, su variante cr y qnrA, B, S, con posterior
secuenciación.
Resultados
Se obtuvieron 30 cepas de enterobacterias portadoras de BLEE. Se detectó
CTX-M en 16/30 aislamientos: K.pneumoniae (8), E.cloacae (4), E.coli (3),
S.marcescens (1). Las más frecuentes fueron: CTX-M-15 (5), CTX-M-2 (5),
CTX-M-9 (5), seguido por CTX-M-8 (1). En 4 casos se encontró qnrA asociado
a blaCTX-M-9 y en 3 casos qnrB1 y aac(6´)Ib-cr asociados a blaCTX-M-15. No se vió
asociación de blaCTX-M-2 a PMQR.
Conclusiones
Se detectaron distintos tipos de CTX-M en enterobacterias aisladas en el HP-
CHPR. El arribo de BLEEs, distintas a CTX-M-2, se asoció a la llegada de
nuevos PMQR. En este sentido, el uso de oxiiminocefalosporinas puede llevar
a una co-selección de genes qnr y aac(6’)Ib-cr.

44. 42) DIVERSIFICACIÓN, TASAS EVOLUTIVAS Y DINÁMICA POBLACIONAL
DEL GENOTIPO III DEL VIRUS DENGUE 3 EN VENEZUELA.
A. Fajardo1
, A. Ramírez2
, R. Recarey1
, Z. Moros2
, G. Caraballo2
, G.
Moratorio1
, F. Liprandi2
, y J. Cristina1
.
1
Laboratorio de Biología de Virus. Centro de Microbiología y Biología Celular.
Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela;
2
Laboratorio de Virología Molecular. Centro de Investigaciones Nucleares.
Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay.
El virus Dengue (DENV) pertenece al género Flavivirus dentro de la familia
Flaviviridae. Comprende 4 serotipos relacionados antigénicamente, Dengue 1 a
Dengue 4 (DENV-1 a DENV-4), que se dividen en diferentes genotipos, y son
transmitidos al humano principalmente por el mosquito Aedes aegypti. En la
actualidad existe una dramática emergencia del genotipo III de DENV-3 en las
Américas. Sin embargo, nuestro conocimiento de las fuerzas evolutivas que
subyacen a la evolución de este genotipo es aún incompleto. El objetivo del
presente estudio fue investigar el grado de variabilidad genética, las tasas y
patrones evolutivos de este genotipo en Venezuela. Para ello, procedimos al
análisis de un gran número de secuencias (n = 116) del gen de la Envoltura
viral (E) de variantes Venezolanas del genotipo III de DENV-3, aisladas entre
2001 y 2008. Los análisis filogenéticos revelaron una evolución in situ de este
genotipo desde su introducción a América Latina, observándose 3 grupos
genéticos distintos (A a C). Asimismo, se observó la co-circulación de cepas
de diferentes clados genéticos en Venezuela. Esto revela al menos 3 eventos
de introducción de cepas del genotipo III de DENV-3 en este país. Por otra
parte, los análisis bayesianos de coalescencia revelaron una tasa evolutiva de
9,1 x 10-4
sustituciones/sitio/año (s/s/a) para las cepas del clado A, compuesto
exclusivamente por cepas de Venezuela. Esta tasa es comparativamente más
alta que las reportadas para otros serotipos, lo que se relaciona con la elevada
capacidad patogénica de este genotipo particular.

45. 43) ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS: ESTUDIO DE LA SÍNTESIS DE
POLIHIDROXIBUTIRATO POR HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE
A.I. Catalán1
, K. Malán1
, G. Martínez2
, V. Saravia2
, M. Rodriguez3
, F.
Ferreira3
, S. Batista1
1
Unidad Microbiología Molecular, IIBCE; 2
Depto. Bioingeniería, Facultad de
Ingeniería (UDELAR); 3
Lab.Carbohidratos y Glicoconjugados, Depto. de
Química Orgánica, Facultad de Química (UDELAR)
El poli-3-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster de la familia de los
polihidroxialcanoatos (PHAs). Algunos microorganismos acumulan PHB como
reserva de carbono. Parte del interés en los PHAs radica en sus propiedades
termoplásticas, biodegradabilidad y biocompatibilidad [1]. Los PHAs son más
costosos que los plásticos convencionales y se investigan distintas estrategias
para abaratarlos. La fuente carbonada es el factor que más contribuye en el
costo, por lo que se ha estudiado el uso de sustratos carbonados económicos y
el incremento del rendimiento de transformación del sustrato carbonado en
polímero.
La especie Herbaspirillum seropedicae pertenece a la subclase β de
Proteobacterias. Son organismos Gram-
, aerobios y diazótrofos. La cepa Z69
de esta especie acumula PHB al ser cultivada en presencia de varios
carbohidratos [2]. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que
la eficiencia de transformación de glucosa en polímero es bastante menor que
la teórica.
El análisis de flujos metabólicos (AFM) permite identificar los flujos que se
expresan en una red metabólica y definir cambios para aumentar la producción
del metabolito de interés [3].
El objetivo del trabajo es obtener un mapa metabólico de la cepa Z69 en
condiciones de producción de PHB mediante el AFM. Se definió un modelo
metabólico que incluye las vías de Entner-Doudoroff, pentosas fosfato,
glioxilato y ciclo de Krebs, en base al genoma de la cepa SmR1 y datos
bioquímicos obtenidos en nuestro laboratorio. Este modelo metabólico es
ajustado de acuerdo a los datos experimentales obtenidos con la cepa Z69
crecida en presencia de glucosa.
Bibliografía
[1] L. L. Madison, G. W. Huisman, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999, 63, 21-53.
[2] A. I. Catalán, F. Ferreira, P. R. Gill, S. Batista, Enzyme Microb.Tech. 2007,
40, 1352-1357.
[3] G. Stephanopoulos, Metabolic eng. 1999, 1, 1-11.
Financiamiento: ANII-FSE-1-2009-46, PEDECIBA-Biología, CYTED-2009
P309RT0120 (PRIBOP)

46. 44) ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE LOS COMPLEJOS DE COBRE,
CASIOPEINAS® CON ADN Y SU ACTIVIDAD ANTI - Trypanosoma cruzi.
L. Becco1
, M. E. Bravo-Gómez2
, L. Ruiz Azuara2
, D. Gambino3
, B. Garat1
[1]
Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, UDELAR,
Iguá 4225, 11400 Montevideo, Uruguay; [2]
Facultad de Química, Departamento
de Química Inorgánica y Nuclear, Universidad Nacional Autónoma de México,
México DF 04510, México; [3]
Cátedra de Química Inorgánica, Facultad de
Química, UDELAR, Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo, Uruguay.
Una serie de complejos de Cu(II) denominados en forma genérica
CASIOPEINAS®, ha sorteado con éxito los estudios preclínicos, mostrando
una actividad antineoplásica contundente sobre diferentes tipos de tumores
(carcinoma de colon (HCT-15), glioma C6, adenocarcinoma mamario), baja
toxicidad y genotoxicidad. Entre los múltiples mecanismos de acción posibles,
se destaca la interacción con el ADN y la inducción de apoptosis. Actualmente,
algunos de estos compuestos están ingresando a fase clínica como potenciales
fármacos anticancerígenos.
Con el fin de contribuir a dilucidar el mecanismo de acción de estos complejos
se profundizó en el estudio de su interacción con ADN. Se encontró que las 7
Casiopeinas estudiadas, en mayor o menor grado degradan el ADN doble
hebra. Algunos miembros parecen presentar una afinidad preferencial por
secuencias ricas en IC. Asimismo la presencia de agentes reductores, como el
ácido ascórbico, potencian el efecto degradativo mientras que agentes
quelantes y scavenger de radicales lo disminuyen. Se vio además que la
Distamicina A estaría potenciando la degradación.
Por otra parte, muchos compuestos anticancerígenos presentan actividad
contra el Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas,
por actuar a nivel del ADN. Por esto se testaron los efectos de las 3
Casiopeinas más activas sobre el crecimiento de T. cruzi (epimastigota) en
cultivo, obteniéndose valores de IC50 comparables a los del fármaco
antichagásico de referencia Nifurtimox.
Agradecimientos: LB agradece a la ANII Uruguay por financiar la beca
BE_INI_2010_1979. Los autores agradecen al Programa Iberoamericano de
Ciencia y Tecnología en el Desarrollo (CYTED) red temática 209RT0380.

47. 45) IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y GENES INVOLUCRADOS EN LA
ACTIVIDAD DE LA SECUENCIA (dTdG)n EN Trypanosoma cruzi.
L. Guggeri1
, P. Smircich1
, L. Pastro1
, M.A. Duhagon1
, B. Garat1
1
Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República, Montevideo, Uruguay.
Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Las
numerosas diferencias en los mecanismos de la regulación génica de los
tripanosomátidos en relación a los eucariotas superiores, hacen que sean
modelos excepcionales para estos estudios. En particular, las secuencias
reguladoras que actúan en cis en los ácidos nucleicos están pobremente
conservadas.
A partir de evidencia bioinformática y experimental postulamos que los
repetidos de dinucleótidos (TG)n funcionan como elementos reguladores de la
expresión génica en T. cruzi (Duhagon y col., 2003, 2011).
Este trabajo busca profundizar en el rol de los repetidos (TG)n en la regulación
de la expresión génica en T. cruzi mediante dos estrategias Primero, una
estrategia experimental para identificar los factores en trans que interaccionan
con dicha secuencia. Para esto se realizó una purificación mediante
cromatografía de afinidad utilizando un oligonucleótido (dTdG)20 biotinilado.
Cuatro de las siete proteínas identificadas presentan antecedentes en la
literatura de unión a ácidos nucleicos (CYCA, MSR, PGFS, IMPDH, OXCT,
Tc38, NDPK1). Aquí se presenta el progreso en el estudio de la nucleósido
difosfato quinasa 1 (TcNDPK1), incluyendo ensayos in vitro utilizando la
proteína recombinante para confirmar la unión específica con las secuencias
(TG)n. Segundo, un enfoque bioinformático, se identificaron los genes que
presentan repetidos (TG)n en el genoma de T. cruzi con el fin de determinar
relaciones funcionales o estructurales entre ellos. Nuestros resultados indican
que las proteínas pertenecientes a familias multigénicas se encuentran
enriquecidas en repetidos (TG)n (i.e 85% de las MASP, 44% de las RHS).
M.A. Duhagon, P. Smircich, D. Forteza, H. Naya, N. Williams, B. Garat (2011)
Gene. 2011 Nov 1;487(1):29-37. Publicación electrónica 2011 Jul 28.
M. A. Duhagon, B. Dallagiovanna, M. Ciganda, W. Ruychean, N. Williams, G.
Garat, (2003) Biochemical and Biophysical Research Communications, volume
309 1, pages 183.

48. 46) ANÁLISIS DE MUTACIONES DEL GEN FMR1 (CAUSANTE DEL
SÍNDROME DE X-FRÁGIL) EN LA POBLACIÓN URUGUAYA
L. Pastro; N. Pi-Denis; A. Tapié; V. Raggio; N. Curbelo; M. Boidi; L. Roche.
Departamento de Genética, Facultad de Medicina, (UdelaR).
El SXF es la causa más frecuente de retardo mental hereditario, con una
incidencia de 1:4000 varones y 1:6000 mujeres. El gen FMR1 contiene una
secuencia repetida CGG altamente polimórfica en el 5´UTR. Las variantes
descritas se pueden clasificar por su tamaño, los individuos normales poseen
entre 5-45 repetidos, una “zona gris” entre 46-50 repetidos, mientras que los
individuos portadores de una premutación poseen entre 51-200 repetidos,
teniendo riesgo de expansión en la descendencia. Los individuos afectados
poseen de más de 200 trinucleótidos. La expansión de los repetidos produce la
metilación del promotor causando la inactivación del gen.
En el marco de un proyecto clínico-molecular en niños con retardo mental,
determinaremos el número de repetidos CGG de FRM1. Incluiremos pacientes
con retardo mental que cumplan los criterios de Giangreco (J.Pediatr 1996) y
pacientes con antecedentes de retardo mental ligado al X. Planteamos la
puesta a punto de la técnica publicada por Tassone (J.Mol.Diagn 2008) para la
determinación del número de repetidos por PCR. Ésta permite discriminar
rápidamente varones normales, mujeres normales heterocigotas y algunas
premutaciones. Para los casos indeterminados realizamos un segundo PCR
con un cebador para los repetidos. Los productos se resuelven en geles de
agarosa-I o de alta resolución 2% no desnaturalizantes. En paralelo, estamos
implementando la utilización de cebadores marcados para determinar las
expansiones mediante electroforesis capilar y/o agarosa. En los casos
dudosos, complementaremos el estudio mediante southern blot y
secuenciación. En este proyecto esperamos aportar nuevos datos de la
prevalencia de la enfermedad en nuestro país.

49. 47) DETECCIÓN DE LOS GENES DE LAS TOXINAS ALFA, BETA Y
ÉPSILON EN CEPAS DE Clostridium perfringens POR LA TÉCNICA DE
PCR
M. Cattáneo1,2
, J. Bermúdez1,2
.
1
Área de Bacteriología, Departamento de Microbiología,
Facultad de Veterinaria (UdelaR), Uruguay; 2
Laboratorios de Investigación y
Desarrollo. CCA. Laboratorios Santa Elena. Uruguay.
Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria anaeróbia causante de
enterotoxemias y gangrenas gaseosas en los animales domésticos. C.
perfringens se clasifica en 5 tipos: A, B, C y D; y mediante la producción de
cuatro toxinas mayores: alfa, beta, épsilon e iota. Se han identificado dos
toxinas nuevas que intervienen en la patogénesis de estas enfermedades, beta
2 y enterotoxina. El diagnóstico de estas enfermedades es complejo debido a la
dificultad para el aislamiento del agente etiológico y para la tipificación de las
toxinas. La identificación de toxinas clostridiales puede realizarce por ELISA,
cultivo celular y seroneutralización en animales de laboratorio utilizando
antisueros específicos, los cuales son adquiridos en centros de referencia
internacionales. El objetivo de este trabajo fue poner a punto la técnica de PCR
para identificar los genes que codifican para las toxinas alfa, beta y épsilon de
C. perfringens. Para este trabajo su utilizaron cepas de referencia
pertenecientes a nuestro Departamento. Se logró estandarizar la técnica de
PCR para la identificación de los genes que codifican para las toxinas alfa, beta
y épsilon. Esto nos permite tener una técnica específica y rápida para la
identificación de toxinas clostridiales los que nos permitirá sustituir las técnicas
serológicas utilizadas hasta ahora. Se continuará trabajando para identificar los
genes de las toxinas iota, enterotoxina y beta 2, y padronización de la técnica
de PCR multiplex para esta especie de Clostridium.

50. 48) DETECCIÓN DE MUTACIONES DE RESISTENCIA AL PALIVIZUMAB EN
AISLADOS DE VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL
N. Farina 1,2
, S. Frabasile 1,3
y J. Arbiza 1,3
.
1
Sección Virología, Facultad de Ciencias UdeLaR; 2
Becario de Agencia
Nacional de Investigación e Innovación; 3
Investigador perteneciente al Sistema
Nacional de Investigadores
Las infecciones respiratorias del tracto respiratorio bajo representan un
problema significativo de salud mundial. El virus respiratorio sincitial (VRS) es
el principal agente de infecciones respiratorias en lactantes y niños pequeños.
Debido a la ausencia de una vacuna para contra VRS el tratamiento de estas
infecciones se basa en el suministro de Palivizumab. El Palivizumab (PZ) es un
anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína F de VRS.
Existen escasos trabajos de vigilancia en la aparición de virus resistentes a PZ.
Dada la importante tasa mutacional de este virus es esperable la generación de
resistencia.
El objetivo de este trabajo fue estudiar el gen de la proteína F de cepas de VRS
correspondientes a años previos al uso de PZ y compararlas con muestras
clínicas extraídas de niños tratados con PZ como profilaxis en busca de
posibles mutaciones responsables de la resistencia a PZ.
Una cepa pre-PZ correspondiente al año 1996, reveló una mutación en la
posición 814 del gen de la proteína F, está mutación fue reportada como
mutación de resistencia al PZ y se aisló a partir de una muestra clínica. En
cuanto a las demás posiciones del gen en las cuales se reportaron mutaciones
de resistencia, no se encontraron cambios en las cepas estudiadas.
Las cepas post-PZ mostraron ser negativas para VRS asimismo una de estas
muestras mostró ser positiva para Adenovirus (AdV).