caracterizacion fenotipica y fisica de DNA recombinante

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Microbiología
Genética Microbiana
CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y
FÍSICA DE DNA RECOMBINANTE
Equipo 6

2. ¿A qué nos referimos con Ingeniería Genética?
Técnicas in vitro de modificación del material genético en el laboratorio.
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

3. Obtención del gen de interés
 PCR
 Síntesis de cDNA
 Digestión con enzimas de
restricción
 Síntesis química
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

4. Nucleasas
Cualquier enzima con capacidad de escindir de los enlaces fosfodiéster, de la cadena
polinucleotídica de los ácidos nucleicos.
 Endonucleasas
 Exonucleasas
 Nucleasas tipo a
 Nucleasas tipo b
pNpNpNpNpNpNpN
pNpNpNpNpNpNpN
Ej. Exonucleasa S1

5. Endonucleasas de restricción
 Gran especificidad de reconocimiento de una secuencia corta de DNA
bicatenario
 Sitios de reconocimiento o restricción
 Tipo I, II y III
Tipo II
Actividad
Estructura proteica
Sitio de reconocimiento
Punto de corte
Punto de metilación
Endonucleasa
1 subunidad
Palindrómico
Las dos cadenas en puntos equivalentes
dentro del sitio de reconocimiento
Adenina o citosina dentro de la secuencia
de reconocimiento

6. Principal función de las enzimas de restricción
La función principal de las enzimas de restricción en los procariotas es proteger a la
célula de la invasión de DNA extraño.
 Modificación de nucleótidos específicos en la secuencia de restricción
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

7. Puntos de corte de la enzima de restricción
Texto ilustrado de biología
molecular e ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2001

8. Preparación del DNA
(insertos)
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

9. Vectores
Elemento genético sencillo, como un
plásmido o un virus, que recibe el
nombre de vector.
Hay:
 Clonación
 Expresión
Tipos de vectores
 Plásmidos
 Virus
 Cromosomas artificiales
 Quimeras: cósmidos, fagémidos,
fásmidos
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

10. Obtención del DNA recombinante
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

11. Productos secundarios
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

12. Transformación.
Modificación genética de un organismo por la incorporación de DNA desnudo.
Se presenta en células competentes.
Competencia: Estado fisiológico que va a permitir a la célula captar,
internalizar, integrar, interpretar y expresar el material genético
incorporado.
Texto ilustrado de biología
molecular e ingeniería
genética, Ángel Herráez. 2012
Tabla 2. Tipos de transformación artificial

13. Transformación
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

14. Competencia
 Choque térmico
 Inducida con CaCl2

15. Regulación del operón lac
OpenStax College, Biology.
 lacZ codifica para B – galactosidada.
 lacY codifica para galactósido pearmeasa
 lacA codifica para tiogalactósido
transferasa
α complementación
Genética bacteriana 2007.
https://www.researchgate.net/file.Po
stFileLoader.html?id...assetKey...

16. Detección y selección de clonas
Texto ilustrado de
biología molecular e
ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012
Resistencia a antibióticos
X-Gal

17. Inactivación
insercional
Texto ilustrado de biología
molecular e ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

18. Detección por hibridación
Texto ilustrado de biología
molecular e ingeniería genética,
Ángel Herráez. 2012

19. Electroforesis en gel de agarosa

20. DNA plasmídico relajado y superenrollado.
DNA circular
DNA lineal
Isoformas del DNA

21. Radioinmunoensayo
Se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos,
entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia
marcada con un isótopo.
A mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia
radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.
Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades
muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una técnica muy sensible
y muy específica.

22. Western blot
Utilizado para la identificación de
proteínas
Se basa en la especificidad de
reconocimiento entre antígeno y
anticuerpo.
Implica:
1. Separación por electroforesis
2. Transferencia
3. Bloqueo
4. Detección
Figura 1. Los antígenos que se han
transferido a la membrana son
reconocidos por anticuerpos
monoclonales o policlonales

23. A r t i c u lo

24. Objetivo general
 Lograr la expresión de un gen sintetizado químicamente para
la hormona de somatostatina en E. coli
Objetivos particulares
 Encontrar la secuencia de codones adecuada para la síntesis
del gen de la somatostatina.
 Evitar la degradación del gen sintetizado de la somatostatina
por enzimas proteolíticas endógenas.
 Conocer los plásmidos que presentan la orientación correcta de
la región controladora del operón lac.
 Lograr que la hormona presente actividad biológica en ratas.

25. Figura 1. Estructura de la somatostatina
 Tamaño pequeño
 Secuencia de aa conocida
 Se conoce su sensibilidad a
radioinmunoensayo
La somatostatina inhibe la
secreción de hormonas:
 GH
 Insulina
 Glucagón
El efecto de la somatostatina
sobre la secreción de estas
hormonas ha atraído la atención
sobre su valor terapéutico
Somatostatina

26. Figura 2. Esquema del plan experimental.

27. Figura 3. Síntesis química del gen de la somatostatina.
Ocho oligonucleótidos
que varían de 11 a 16
nucleótidos marcados
de A a H.
Con reconocimiento
para las endonucleasas
de restricción Eco RI y
Bam HI
1. Codones de sencilla elección sabiendo que el fago MS2
expresa su material genético fácilmente en
2. Evitar secuencias que den origen a formas de asa en el
DNA.
3. Evitar secuencias ricas en G-C y A-T

28. Figura 4. Construcción de plásmidos recombinantes.
Figura 5. Secuencias de nucleótidos de los plásmidos lac –
somatostatina.
Promotor lac de λplac5
ECO RI/PST de PSOM 1
son retiradas y
sustituidas por ECO
RI//PST DE PBR322
Se retira el sitio Eco RI
distal al operon lac
Las transformantes se
seleccionaron por
resistencia a tetraciclina y
ampicilina

29. Conclusión:
 pSOMII-3, pSOMII-5,
pSOMII-6 y pSOMII-7 tienen
la orientación adecuada del
operón lac por lo que
presentan actividad
radioinmune.
Figura 6. Actividad radioimune de las diferentes clonas.

30. Figura 8. Competencia de pSOMII – 5 por el
anticuerpo en radioimunoensayos.
Conclusión:
Clona pSOM 11-5 compite con
la somatostatina comercial a
diferencia de pSOM 11-4 que no
lo hace.
Somatostatinamarcada/somatostatinaobtenida
Microlitros

31. Figura 7. Elución de la somatostatina sintetizada
y de la somatostatina comercial
Conclusión:
 El perfil de elución de la
somatostatina sintetizada es
igual a la de la somatostatina
comercia.
 Al modificar un aminoácido
el perfil de elución se
desplaza.

32. Tabla 2. Actividad especifica radioimune de la somatostatina.
Conclusión:
 El IPTG induce al
operon lac, por lo
que sintetiza más
somatostatina
 Se necesita de la
escisión con
bromuro de
cianógeno para
obtener la
somatostatina
activa.

33. Figura 9. Electroforesis de los fragmentos de la somatostatina.
1) Fragmentos A, B, E y F
2) Fragmentos C, D, G y H
3) Ambos fragmentos juntos
4) Inactivación de la ligasa
5) Bam HI
6) Eco RI
7) Gen de la somatostatina

34. Conclusión:
 La somatostatina obtenida por
clonación presentó actividad
biológica.
 pSOM11-3 inhibió liberación de GH
en células de glándula pituitaria.
 pSOM 11-2 no tuvo efecto en la
liberación de GH

35. Desarrollo experimental
Caracterización fenotípica y
física de DNA recombinante

36. Objetivos
 Obtener DNA de doble cadena de los plásmidos recombinante y no
recombinante derivados del pCR2.1 – TOPO
 Obtener células competentes de E. coli y transformarlas
 Diferencias un vector recombinante de uno no recombinante por pruebas
fenotípicas y de restricción.

37. Medios de cultivo
 Caldo luria (L)
 Agar Luria (L)
 Agar Luria con ampicilina (L-Ap)
Cepas
 Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO.
 Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO-
ape. (plásmido recombinante con un inserto de 1.2 kpb que contiene el
gene que codifica la aminopeptidasa del hongo Ustilago maydis).

38. 1 er. Dia
E. Coli DH10B
• Con plásmido recombinante
(cultivo A)
• Sin plásmido recombinante
(cultivo B).
10 mL medio L-Ap.
10 mL medio L-
Ap.
Incubar
toda la
noche a 37º
C.

39. A. Obtención del DNA de los plasmidos Pcr2.1 – TOPO recombinante y no recombinante utilizando la
técnica de lisis acalina
1.5 mL
A y B
12000 xg por 2
minutos.
+ 100 µL
sol.
Birnboim
y Doly
(1BD)
200 µL de la sol. IIBD
(recién preparada a
cada tubo).
5 veces ¡NO
USAR
VORTEX!
Incubar
en hielo 5
min.
Añadir 150 µL de
sol. III BD fría a
cada tubo. Agitar
suavemente 10
min. Incubar en
hielo por 5 min.
12000 xg por 5 minutos, a 4ºCTUBOS
NUEVOS. 400
Añadir a cada
tubo 400 µL de
fenol:cloroform
o:alcohol
isoamilico
(25:24:1) 12000 xg 10 min.

40. Transferir a tubos
nuevos.
Adicionar 2 vol. de etanol
absoluto. Mantener los
tubos 5 min. En frio
(precipite DNA)
12000 xg 5 min. A 4ºC
Descartar SN y
lavar DNA con 1
mL de etanol al
70% enfriado a -
20 ºc.
12000 xg 5 min. A 4ºC
Descartar SN,
centrifugar por 2
min. Y descartar
el exceso de
etanol.
10 a 30 minutos
(evaporación del
etanol)
Disolver el DNA en 30 µL
de TE (pH 8.0) o agua
bidestilada estéril, guardar
a -20ºC.

41. B. Obtención de las células competentes de la cepa E. coli DH10B
1er. Dia. Inocular con una colonia o una asada la cepa E. coli DH10B en mL de medio L suplementado con
estreptomicina a una concentración final de 100 µg/mL e incubar a 37ºC con agitación durante toda la noche.
2do. Dia
100 mL de medio L
con 500 µL del
cultivo obtenido del
paso anterior.
Incubar a 37ºC con
agitación durante 2 a 4
horas, hasta 600 nm
entre 0.5-0.7
10 minutos. Transferir el cultivo a un
tubo de centrifuga estéril
mantenido en baño de
hielo.
10 minutos en frio.
Eliminar SN
en condiciones
de esterilidad
Adicionar 25 mL de una
sol. De transformación
estéril (CaCl2 100 mM;
MgCl2 5 mM; Tris-HCL 5
mM pH 7.5, recién
preparada y enfriada
mantenida en baño de
Incubar en
baño de
hielo 30 min.
5000 xg por 10 min.
A 4ºC. Eliminar SN
en condiciones

42. Re suspender en 2mL de la
sol. De transformación
fría, con suavidad.
Adicionar 500 µL de glicerol
estéril y mezclar suavemente.
Mantener en baño de hielo
para su inmediata
transformación o preparar
alícuotas de 30 µL en
microtubos de 1.5 mL y
conservar a -70ºC.

43. C. Transformación con los plásmidos pCR2.1-TOPO (no recombinante) y pCR2.1-TOPO-ape
(recombinante).
Los siguientes pasos se trabajaran en condiciones de esterilidad.
Descongelar 5 alícuotas de
cel. Competentes (paso B-9)
en hielo y marcar los tubos
del 1 al 5.
Descongelar el DNA de los
plásmido pCR2.1-TOPO
(recombinante y no
recombinante), obtenidos en el
paso A-12.
Agregar el DNA a los
tubos que contienen cel.
Competentes de acuerdo
al siguiente protocolo.
Tubo 1 2 3 4 5
DNA pCR2.1-TOPO (µL) - 3 5 - -
DNA pCR2.1-TOPO-ape (µL) - - - 3 5
• Incubar en baño de hielo de 20-30 min.
• Colocar los tubos a 42ºC por 45 seg. Y transferirlos
inmediatamente a un baño de hielo por 1 minuto.
• Añadir 300 µL de caldo L e incubar en agitación a 37ºC
durante 45 a 60 segundos.

44. Adicionar a placas con agar
L-Ap, 20 µL de ampicilina
(100mg/mL) y 20 µL de sol.
De X-gal (20 mg/mL).
50 µL de las células contenidas en los
tubos 1 a 5 sobre cajas con medio L-Ap y
Xgal. Las células del tubo uno se
siembran también en una caja con
medio L.
Dejar secar las cajas e
incubar a 37ºC por 24
horas.
Contar el numero de colonias
transformantes e interpretar los
resultados en función de los
indicadores utilizados y el color
de las colonias.
D. Restricción del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO y pCR2.1-TOPO-ape.
1. Con las muestras de DNA obtenidas en el paso A-12 desarrollar el siguiente protocolo.
2.Tubo numero 1 2 3 4 5 6
DNA pCR2.1-TOPO (µL) 5 5 5 - - -
DNA pCR2.1-TOPO-ape (µL) - - - 5 5 5
Regulador (µL) 1 1 1 1 1 1
BamHI (UI/µL) (µL) 1 - - 1 - -
EcoRI (UI/µL) (µL) - 1 - - 1 -
Agua (µL) 3 3 4 3 3 4
Incubar todos los
tubos a 37ºC durante
2 h como mínimo.
Mantener los tubos
así tratados en
refrigeración hasta
su uso.

45. Separación electroforética del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO y
pCR2.1-TOPO-ape restringidos con las enzimas Bam HI y Eco RI.
a. Preparación del gel de agarosa.
Pesar 0.25 g, disolver en 25
mL de solución TAE.
Concentración 1%.
5 minutos. Agitar
con precaución.
Dejar enfriar hasta 50-55 ºC
Delimitar con cinta adhesiva
o con gomas de la cámara.
Colocar el peine a 0.5 cm de
un extremo.
Dejar solidificar 20
minutos, remover el peine
y las gomas.

46. Desarrollo de la electroforesis.
Llenarla con sol. TAE
hasta 0.5 cm sobre la
superficie del gel.
Adicionar 3 µL de
RNAsa (200 mg/mL),
incubar 20 min a 37 ºC
2 µL de regulador
de carga, 6 µL de
agua bidestilada 1
µL de DNA del
bacteriófago λ( R.
Hind III).
A 65ºC por 5
min.
Mezclar con 3
µL de regulador
de carga.
• Marcador de
tamaño
molecular.
• DNA plásmidos,
Vector y
Recombinante.
Aplicar una corriente de
100 V por 40 minutos.
Sumergirlo en sol. TAE
con 0.5 µg/mL de
bromuro de etidio
durante 20 minutos.

47. Determinar distancias, de migración
en cm para fragmentos de restricción
y para fragmentos del marcador.
Marcador de tamaño molecular (Fago λ
digerido con Hind II)
Banda Tamaño (pb)
1 23,130
2 9,416
3 6,557
4 4,361
5 2,322
6 2,027
7 564
8 125
El orden de las bandas es de la menor a la mayor
migración en el gel de electroforesis.
Logdeltamañode
losfragmentos
Distancia de migración

48. Bibliografía
 Herráez Ángel, “Texto ilustrado e interactivo de Biología molecular e ingeniería genética” 2ª
edición, ELSEVIER. 2011.
 García, José Luis, “Ingeniería genética y biotecnología”. Centro de Investigaciones Biológicas.
Consejo Superior de Investigaciones Científicas.
 Tecnología del dna recombinante, disponible en sitio web:
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pd
f
 Introduction to Blue-White Screening – Background and Protocols for Colony Selection, disponible
en sitio web:
https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/blue-white-screening.html
 Regulación genética en bacterias, disponible en sitio web:
https://es.khanacademy.org/science/biology/gene-regulation/gene-regulation-in-bacteria/a/overview-
gene-regulation-in-bacteria
 Ingeniería genética y microorganismos transgénicos, disponible en sitio web:
http://informersalamanca.com/contenido/up/1353/anafouces-
20150511154231/docs/Tema_7_micro.pdf