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ARTICULO HIPOXIA EN C. ELEGANS.pptx

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  1. 1. ARTICULO HIPOXIA EN C. ELEGANS Presenta Leonardo H. Hernandez Ph.D.
  2. 2. INTRODUCCION ■ H2S exógeno tiene profundos efectos fisiológicos ■ mejor resultado después del infarto de miocardio en mamíferos (Elrod et al., 2007; Simon et al., 2008) ■ mayor esperanza de vida en nematodos (Miller y Roth, 2007). ■ pequeñas cantidades de H2S reducen la tasa metabólica basal y el consumo de oxígeno 10 veces menos y exhiben una reducción correspondiente en en ratones (Blackstone et al., 2005) ■ H2S también mejora la supervivencia de los ratones en hipoxia (Blackstone y Roth, 2007).
  3. 3. HIF-1 (Cerychova and Pavlinkova 2018) (Shao et al. 2010) • usaron C. elegans para estudiar la influencia de H2S en HIF-1 • hif-1 es necesario cuando los nematodos están expuestos a H2S. • ↑HIF-1 ---> ↑concentración máxima tolerable de H2S. • H2S e hipoxia causan aumento tanto de la concentración y localización nuclear de HIF-1. • H2S e hipoxia son distintos, con diferentes patrones de actividad transcripcional de HIF- 1
  4. 4. MATERIALES Y METOD0S Cepas ■ N2 Bristol ■ CB5602, vhl-1(ok161) ■ JT307, egl-9(sa307) ■ ZG31 hif01(ia04) ■ CB6088, egl-9(sa307), hif-1(ia04) ■ CB6090, vhl-1(ok161), hif-1(ia04) ■ ZG120 nhr-57::gfp(iaIs07) ■ Cámaras atmosféricas – atmósfera de 5 ppm de H2S atmósferas que contienen H2S (5000 ppm de H2S con aire ambiente) – La cámara hipóxica tenía 5000 ppm de O2 con nitrógeno. ■ Prueba de viabilidad – larvas L4 se trasladaron a la cámara que contiene H2S durante 24 h ■ Producción de anticuerpos – generó el anticuerpo monoclonal contra HIF-1 en ratones ■ Inmunotinción ■ Análisis de Western Blot ■ Cuantificación de ARNm ■ Microscopía de fluorescencia de
  5. 5. RESULTADOS ■ Supervivencia de C. elegans en H2S ■ C. elegans expuestos a atmósferas que contienen H2S en el aire ambiente durante 24 h. La supervivencia dependía de la dosis, con gusanos de tipo salvaje que sobrevivieron 50 ppm de H2S pero no 150 ppm de H2S.
  6. 6. Figura complementaria 1 La inmunotinción muestra que el anticuerpo generado es específico para HIF-1. egl-9 (sa307) y vhl-1 (ok161) tienen niveles constitutivamente altos de HIF-1 por inmunotinción. hif-1 (ia04) demuestra la tinción de fondo. Las imágenes son apilados de todos los núcleos visibles con tinción DAPI. Los animales se tiñeron con anticuerpo anti-Ce-Hif-1 (a, d, g) y DAPI (b, e, h) para visualizar los núcleos. Los núcleos hipodérmicos (flechas sin cola) y los núcleos intestinales (flechas con cola) se observan claramente en las imágenes fusionadas (c, f, i). El tiempo de exposición es más corto que el que se muestra en la Figura 3, para evitar la sobreexposición. (A) Anterior del gusano. (B) Posterior del gusano. Barras de escala, 50 µm. mAb específico para C. elegans HIF-1
  7. 7. Figura complementaria 2. Este anticuerpo reconoce dos bandas presentes en egl-9 (sa307), pero ausentes en hif-1 (ia04). Las bandas migran con un peso molecular aparente de 113 y 106 kilodaltons. Figura 1. Los niveles de proteína HIF-1 aumentan cuando los gusanos están expuestos al H2S. (A) Un análisis representativo de Western blot muestra que la proteína HIF-1 aumenta cuando los gusanos se exponen a 50 ppm de H2S o 0,5% de O2. Se recortaron las manchas y reexaminaron con un anticuerpo anti-actina para confirmar cantidades equivalentes de proteína total. Los marcadores de tamaño se muestran en kilodaltons. (B) Aumento promedio de la señal en relación con el control ± SD de tres experimentos independientes. * p < 0.05 (prueba t de Student) en comparación con animales
  8. 8. Figura 2. La exposición al H2S causa la localización nuclear de HIF-1. Tanto el tratamiento con H2S como la hipoxia (0.5% O2) inducen la localización nuclear de HIF-1 en todo el animal. Las imágenes son apilados de todos los núcleos visibles con tinción DAPI. Los animales se tiñeron con anticuerpo anti-Ce-Hif-1 (a, d y g) y DAPI (b, e y h) para visualizar los núcleos. Los núcleos hipodérmicos (flechas sin cola) y los núcleos intestinales (flechas con cola) se observan claramente en las imágenes fusionadas (c, f e i). (A) Anterior del gusano. (B) Posterior del gusano. Barras, 50 µm.
  9. 9. Figura 3. La exposición a H2S aumenta la expresión de NHR-57::GFP. Un plano medio focal de una microfotografía confocal fluorescente y una micrografía Nomarski. La fluorescencia no es aparente en animales transgénicos L4 nhr-57::gfp(iaIs07) no tratados. Un animal nhr-57::gfp(iaIs07) expuesto a hipoxia exhibe actividad HIF-1 en el intestino pero ausente en la hipodermis. A las 1 h del tratamiento con H2S, la fluorescencia es evidente en la hipodermis en todo el animal, pero no se puede detectar en el intestino. La fluorescencia se vuelve más intensa hasta las 3 h de exposición. nhr-57::gfp(iaIs07); los animales hif-1 (ia04) no muestran fluorescencia, independientemente del tratamiento con H2S. Barra, 40 µm.
  10. 10. Figura 4. La exposición a H2S aumenta los niveles de ARNm de los genes diana HIF-1. La PCR de transcripción inversa en tiempo real se utilizó para cuantificar los niveles de ARNm de los genes diana HIF-1 en gusanos de tipo salvaje o hif-1 (ia04) expuestos a H2S o hipoxia. El ADNc de nhr-57 (A) o K10H10.2 (B) se muestra como el aumento promedio ± SD en relación con los niveles de ADNc de sir-2.1, que no cambian durante la exposición al H2S.
  11. 11. Figura 5. La actividad de HIF-1 dependiente de H2S es independiente de VHL-1. El nhr-57::gfp (iaIs07); egl-9(sa307) exhibe una fluorescencia intensa evidente en todo el animal, incluso en la hipodermis y el intestino. 100 animales nhr-57::gfp(iaIs07);vhl-1(ok161) no tratados, muestran expresión basal de GFP en el intestino y el tratamiento con H2S induce la expresión hipodérmica. Estos resultados son representativos de 100 de 100 gusanos examinados para cada panel. Barra, 40 µm.
  12. 12. DISCUSION ■ Las células tienen múltiples formas de activar las respuestas HIF. ■ Tanto el sulfuro como el cianuro interrumpen la respiración celular como inhibidores no competitivos del citocromo oxidasa ■ Por lo tanto, HIF-1 ayude a superar la toxicidad aliviando el estrés de la actividad impedida del citocromo oxidasa. Quizás aumentando la expresión de genes que codifican enzimas glucolíticas (glucolisis anaerobia). ■ La expresión inducida por H2S de un informador para la actividad de HIF-1 no requiere vhl-1 pero sí requiere egl-9. ■ H2S puede estar involucrado en dos pasos de activación de HIF-1: estabilización de proteínas y activación transcripcional. ■ Una posibilidad para las diferencias observadas es que el intestino se hace más fácilmente hipóxico y la hipodermis se expone más fácilmente al H2S. ■ Además, la superposición casi perfecta de la actividad HIF-1 en hipoxia y animales nulos vhl- 1 argumenta que las diferencias observadas reflejan algo intrínseco al tejido, que tal vez implique factores de transcripción adicionales. ■ HIF-1 puede estar involucrado en la aclimatación a entornos que contienen H2S. ■ exposición al H2S aumenta la actividad de HIF-1 y aumenta la tolerancia a una mayor exposición al H2S. preacondicionamiento de la hipoxia

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