Disrupción celular
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Disrupción celular
- 1. Procesos de Bioseparación Universidad Politécnica del Estado de Morelos M.C. Guillermo Garibay Benítez Rompimiento Celular
- 2. Conceptos Algunos de los productos biotecnológicos son extracelulares y no requieren ser extraídos de la célula Si el producto es intracelular, una vez realizada la separación gruesa de las células, una operación necesaria para la liberación del producto es el rompimiento de la misma
- 3. Cuerpos de Inclusión Algunas proteínas eucarióticas recombinantes producidas por microorganismos no son secretadas por la célula recombinante y constituyen productos intracelulares, los cuales pueden estar en forma activa o desnaturalizada. Las proteínas intracelulares desnaturalizadas con frecuencia forman cuerpos de inclusión insolubles.
- 4. Fundamentos Estructura de la pared celular Sistemas celulares de secreción Métodos de rompimiento celular Métodos de permeabilización celular
- 5. Estructura de la pared celular
- 8. Sistemas Celulares de Secreción Se llama secreción al movimiento de un soluto a través de la membrana celular al exterior de la célula. También se considera como secreción cuando, como en el caso de algunas proteínas, estás quedan atrapadas en el espacio periplásmico o entre la membrana y la pared celular.
- 9. Métodos de Rompimiento Celular Método Técnica Principio Ejemplos Químico Choque Osmótico Ruptura Osmótica de membrana Ruptura de Globulos Rojos Disolución Lípidica Desestabilizació n de la pared celular por solventes orgánicos Rompimiento de Levaduras por tolueno Digestión enzimática Digestión de la pared celular Tratamiento Alcalino Solubilización de membranas por saponificación
- 10. Métodos de Rompimiento Celular Método Técnica Principio Ejemplos Mecánico s Molido en molinos de perlas Las células son prensadas entre perlas de vidrio Tratamiento de suspensione s celulares a gran escala Homogeneizaci ón Las células se rompen por fuerzas de corte al pasar por un orificio pequeño Tratamiento de suspensione s celulares a gran escala
- 11. Osmósis
- 12. Choque Osmótico Las células son primero equilibradas en un medio de alta presión osmótica (e.g. 1M sacarosa), luego son rápidamente diluida. El agua entra rápidamente a la célula, incrementando la presión osmótica causando lisis. Técnica restringida a células debilitadas. Choque osmótico suave permite liberar proteínas en E. coli sin afectar la viabilidad celular. Puede ser utilizada para liberar proteínas
- 13. Digestión Enzimática Lisis utilizando Fagos; la adición del bacteriofago T4 causa lisis, sin embargo no es muy recomendable a escala industrial ya que los fagos residuales pueden llevar a una lisis prematura en lotes subsecuentes. Lisozimas. Alto costo de las enzimas. Inmovilización celular.
- 14. Permeabilización Alterar la estructura de la pared y la membrana celular para facilitar la difusión del producto hacia el exterior de la célula.
- 16. Detergentes
- 17. Disolución Lipídica (extracción por solventes) Los solventes no polares permeabilizan las células permitiendo la liberación de proteinas. Los solventes actúan disolviendo componentes hidrofóbicos en la pared, como lo son los fosfolipidos en bacterias gram-negativas. Uso limitado debido a que pueden inhibir las actividades biológicas.
- 19. Equipo de Rompimiento Celular Molinos de Perlas de Alta Velocidad Homogeneizadores de Alta Presión Microfluidizadores
- 20. Molino de Perlas
- 22. Velocidad del agitador La velocidad periférica normalizada de los anillos se utiliza para comparar molinos diferentes. Para impulsores montados excéntricamente: con Donde: Dm = Diámetro promedio de los anillos excéntricos (mm). Para el caso de impulsores concéntricos se utiliza directamente el diámetro del impulsor e = Diámetro de la flecha del agitador (mm) d = Diámetro de los anillos del agitador (mm) n = Velocidad angular del agitador (rpm)
- 24. Operación Intermitente Molino Perlas El rompimiento celular intermitente en molinos de perlas agitados a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. La ecuación para la operación intermitente es: Donde: Rm = concentración máxima de proteína obtenible (M/L3) R = concentración de proteína liberada en el tiempo (M/L3) t = tiempo de operación (tiempo de residencia de las células en el molino k = Constante de velocidad específica de primer orden, depende de tipo de célula, tipo y velocidad del agitador,
- 25. Liberación de proteína a partir de S. cerevisae en un molino de perlas utilizando diferentes agitadores
- 26. Cinética de rompimiento intermitente En el rompimiento intermitente para la obtención de una enzima de S. cerevisae, se utilizó un molino de perlas de alta velocidad de 4 litros obteniéndose los siguientes datos: tiempo (s) R x 102 (Kg/Kg) 0 0 15 1.025 30 2.150 45 2.525 60 3.425 Máx 10
- 27. tiempo (s) A x 102 (mol/min- Kg) 0 0 15 0.625 30 1.150 45 1.675 60 2.150 Máx 6.700
- 28. Tarea Tiempo de Residenci a (min) Ln (Rm/Rm-R) 3 0.037 5 0.090 10 0.160 15 0.225 20 0.300 25 0.365 30 0.437 Tiempo de Residenci a (min) Ln (Rm/Rm-R) 3 0.060 5 0.150 10 0.225 15 0.325 20 0.425 25 0.525 30 0.650 La desintegración celular intermitente con dos tipos de agitación utilizados en un molino de perlas producen los siguientes datos:Agitador 1 Agitador 2 Estimar la cociente cinética (k) para cada tipo de agitador Calcule el tiempo para el cual se obtiene el 80% de rompimiento con cada tipo de agitador
- 29. Métodos directos de medición de rompimiento celular Rompimiento promedio (L) Donde: C0 = Conteo de células intactas al inicio C = Conteo de células intactas
- 30. P1 = 850 bar, P2 = 500 bar,
- 31. Bibliografía Tejeda-Mansir, A., Montesinos-Cisneros, R.M. y Guzmán, R. 1995. Bioseparaciones. UniSon, México Panda A.K., Bioprocessing of Therapeutics Proteins from the Inclusion Bodies of Escherichia Coli, Adv Biochem Engin/Biotechnol (2003) 85: 43–93
Notas del editor
- La formación de cuerpos de inclusión es principalmente atribuida a la sobreexpresión de proteínas recombinantes en una célula que carece de los accesorios para su plegamiento en la forma nativa. Los cuerpo de inclusión son partículas densas de proteínas agregadas encontradas en los espacios plásmicos y periplásmicos de las celulas como E. coli Entre las estrategias para la recuperación de proteína bioactiva involucra el aislamiento y purificación de los cuerpos de inclusión, solubilización de los agregados de proteína, purificación y replegamiento de la proteína solubilizada. Solubilización: con altas concentraciones (6-8 M) de agentes como la urea, guanidina hidrocloruro, sales tiocianato o detergentes como SDS Agentes reductores como el DTT Cambios de pH Renaturalización: dialisis después de remover los agentes que sirvieron para la solubilización, agentes oxidantes
- La recuperación óptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las células: la membrana y la pared celular. Requiere además del conocimiento de los sistemas que permiten a ciertas células secretar los productos de interés en forma activa evitando con esto la necesidad de romper la célula para recuperar el producto.
- Las paredes celulares de las bacterias gram-positivas y gram negativas tienen una característica común: un esqueleto de peptidoglucano o mureína. En las células gram-positivas la capa de peptidoglucano es mucho más gruesa que en las células gram-negativas. En éstas la capa de peptidoglucano se encuentra localizada en el espacio periplásmico enlazandose covalentemente a las lipoproteínas de la capa exterior de la pared celular. La estructura del peptidoglicano de la pared celular bacteriana es resistente a la acción de enzimas que hidrolizan péptidos, las cuales no atacan a los D-aminoácidos como los que se encuentran en la estructura de la pared.
- La unidad básica que se repite en la estructura del peptidoglucano es la del disacárido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el ácido N-acetilmuránico. En las células gram positivas la enzima lisozima se utiliza para el rompimiento celular ya que su mecanismo de acción es el rompimiento de los enlaces glucosídicos del esqueleto polisacárido del peptidoglucano, que en este tipo de células se encuentran la parte externa. Una vez roto el esqueleto de esta manera, la célula se expande con la consecuente ruptura de la membrana y liberación del contenido celular. La diferencia en el grosor de la capa de peptidoglucano y su ubicación, permite que las células Gram-positivas sean más sensibles a la acción de la lisozima que las gram negativas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas que presentan dificultad al rompimiento por la lisozima, pueden romperse en molinos de perlas de vidrio.
- Cuando una membrana semipermeable separa dos soluciones de diferente concentración de soluto, se produce un movimiento neto de agua a través de la membrana hacia el compartimiento que contiene el soluto más concentrado. La presión osmótica es la fuerza que debe aplicarse para contrarrestar la fuerza de flujo osmótico producido. La presión osmótica es una de las propiedades coligativas de las soluciones; depende del número de partículas de soluto por unidad de volumen pero es independiente de la naturaleza molecular del soluto y de la forma de sus partículas.
- Los detergentes son moléculas anfipáticas que tienen una región hidrofílica, la cual es frecuentemente iónica, y una región hidrófoba, usualmente un hidrocarbono. Como tal, son capaces de interactuar tanto con el agua como los lípidos. Los surfactantes se unen a la membrana lípidica hasta que la saturación es alcanzada en alguna proporción surfactante-lípido. La adición continua de surfactantes lleva a la formación de mezclas de micelas que contienen lípidos de la membrana. Esto continúa hasta que todo el lípido esta contenido dentro de las mezclas micelares. La adición de surfactante más allá de este punto lleva a la formación de micelas de surfactante
- La operación de rompimiento celular a nivel industrial actualmente se realiza en tres tipos de equipos
- Los molinos de perlas de alta velocidad constan fundamentalmente de un cilindro en posición horizontal (o vertical) llamado cámara de molienda, un agitador que consiste de una flecha giratoria sobre la que se monta un sistema de discos, barras o anillos que provoca el movimiento del contenido del molino, y una gran cantidad de pequeñas perlas de vidrio que son los elementos activos de molienda. El material celular se introduce por uno de los extremos de la cámara de molienda. El agitador produce el movimiento necesario de la masa celular y las perlas de vidrio. Los discos presentan perforaciones cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no así el de las perlas.
- Los discos presentan perforaciones cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no así el de las perlas. Los discos o impulsores pueden montarse sobre la flecha ya sea en forma concéntrica o excéntrica
- El resultado muestra claramente que la desintegración celular sigue una cinética de primer orden independiente del tipo de agitador. Observándose también diferentes valores de k para cada tipo de agitador. Las gráficas de ln(Rm/(Rm-R)) vs t producirán rectas de pendiente k y ordenada al origen cero