Química de Productos Naturales: generalidades sobre las técnicas cromatográficas mas utilizadas en este campo de investigación

1. CROMATOGRAFÍA
Dra. Haydelba D’ Armas, PhD
Mayo de 2014

2. 2
TECNICAS SEPARATIVAS
Clasificación:
Precipitación.
líquido - líquido
Extracción
en fase sólida
Destilación
Cromatografía

3. 3
CROMATOGRAFÍA
Definición:
“Es una técnica capaz de separar compuestos en
base a diferencias de su afinidad por una fase
estacionaria y una móvil”.
Sistema Cromatográfico:
Fase Móvil
Fase Estacionaria
Soluto

4. 4
Proceso Cromatográfico (1)
Proceso físico - químico que rige la separación:
• Adsorción:
El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas
sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno
superficial, aumentado con la formación de puentes
de hidrógeno
• Partición o Reparto:
El soluto se equilibra entre el líquido de la fase
estacionaria y la fase móvil, por diferencia de
solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio

5. 5
Proceso Cromatográfico (2)
• Intercambio Iónico:
Los aniones o cationes se separan en base a una
columna rellena con un intercambiador de iones (
resina)
• Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:
No existen interacciones entre la fase estacionaria
y el soluto. Se separa por tamaño de partícula

6. 6
Fase
estacionaria
Fase
móvil
Proceso
cromatográfico
Capa fina
Columna
Adsorción
I. Iónico
Exc. Molecular
Columna Adsorción
Papel
Capa fina
Columna
Partición
Columna Partición
Líquida
Líquida
Sólida
Líquida
Gas
Gas
Técnica
cromatográfica

7. 7
1. Fundamentos
Fig.1
1903: usó columnas de adsorción para separar
Tswett (1872-1919)
Fase
móvil
pigmentos vegetales
Pigmentos
vegetales
Fase
estacionaria
Chroma: color
Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA

8. 8
Según la disposición de la fase estacionaria:
•Cromatografía plana:
Cromatografía en capa fina
Cromatografía en papel
•Cromatografía en columna:
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
Cromatografía de fluidos supercríticos

9. 9
Fase estacionaria
CROMATOGRAFÍA PLANA
Papel Cromatografía en papel
Adsorbente sobre soporte Cromatografía
en capa fina
Gel de sílice, poliamida….
Lámina de vidrio, de plástico o
metálica
METODOLOGÍA DE TRABAJO
1
2 3 4
5
Papel
Tapadera
Fase
móvil

11. Cromatografía en capa fina
11
(CCF)
CCF en
solventes
de distintas
polaridades

12. 12

14. 14
La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedad
o bajo la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía)
x
a
b
Rf 
a
b
a - distancia recorrida por el
analito.
b - distancia recorrida por el
frente

15. •La cromatografía en capa fina es una técnica para
determinar el número de componentes de una
mezcla y como una prueba preliminar para realizar
una cromatografía en columna, entre otros
•El proceso de cromatografía en columna se
controla por cromatografía en capa fina, de tal
manera que se puede separar cada componente de
la mezcla
•La cromatografía en columna se usa para separar
grandes cantidades de material: >100 mg. El
proceso de cromatografía consta de una fase móvil
(eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los
cuales dependen de las sustancias

16. 16
Fase Móvil
-COOH
-OH
-NH2
-SH
-CHO
- CO
-COOR
-OCH3
Hidrocarburos No Saturados
Hidrocarburos Saturados
Ácidos carboxílicos
Alcoholes
Aminas
Tioles
Aldehidos
Cetonas
Esteres
Éteres
Alta
Baja
Polaridad

17. 17
Técnica de Revelado: bañado o pulverización
Clasificación de reveladores
.
H2SO4
I2
Lámpara ultravioleta
Destructivo
No Destructivo
H2SO4 (o con molibdato de amonio o vainilina)
Lámpara ultravioleta
I2
Ftalato de anilina (azúcares)
Ninhidrina (Amino-ácidos)
Resorcina (Cetosas)
Difenilamina + UV 254 (I. Clorados)
Generales
Selectivo
Específico

18. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
EMPAQUETADO
COLUMNA
LECHO
CROMATOGRÁFICO
f. estacionaria
COLUMNA
llave
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
MUESTRA
APLICACIÓN
MUESTRA
RESERVORIO
f. móvil
FLUJO
gravedad
DIFUSIÓN
SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO

19. Fase
móvil
Fase
estacionaria
Muestra
(A+B)
B
A
B
B
A B

22. Según el tipo de fase móvil:
•Cromatografía de
líquidos (LC)
•Cromatografía de
gases (GC)
•Cromatografía de
fluidos supercríticos
(SFC)
En columna o en superficie plana
En columna

23. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN
Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio
LC Reparto Líquido adsorbido sobre un
sólido
Distribución entre líquidos
inmiscibles
Adsorción Sólido Adsorción
Intercambio
iónico
Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico
Exclusión por
tamaños
Líquido en intersticios de un
sólido polimérico
Distribución/Exclusión
GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un
sólido
Distribución entre gas y
líquido
Gas-sólido Sólido Adsorción
SFC Especies orgánicas enlazadas a
superficie sólida
Distribución entre fluido
supercrítico y superficie
enlazada
COLUMNA

24. El proceso cromatográfico
Fase
estacionaria
Fase
móvil
Muestra
(A+B)
A B
B
B
Detector ● ● ● ●
●
A
B
● ●
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
Señal analítica
A
B
Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
24

25. Parámetros fundamentales
Respuesta del detector
Tiempo
Inyección
CH4 Octano No
identificado
Nonano
tr´ = tr - tm
tr =tiempo de retención o el que transcurre desde el momento
de la inyección de la muestra hasta la aparición de la máxima
concentración del compuesto eluido en el detector
tm= tiempo muerto o cuando un compuesto no sufre ninguna interacción con la fase
estacionaria. tr´ = tiempo de retención corregido o la interacción del soluto con la fase
estacionaria
25

26. Aplicaciones de la cromatografía ANÁLISIS CUALITATIVO
Señal analítica
Disolución estándar
CH4 Octano Nonano Decano
Tiempo
Señal analítica
CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?
Tiempo
Muestra
La muestra no contiene
metano ni octano.
Si los contiene será a
concentraciones inferiores
a los correspondientes
límites de detección
Identificación positiva: - Comparación de datos de retención
- Uso de detectores en línea
26

27. ANÁLISIS CUANTITATIVO •La cromatografía cuantitativa en
27
Señal analítica
Altura, h
Área
t Tiempo r tm
MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO
A. Calibración con patrones:
0 5 10 15 20 25 30
Concentración, ng ml-1
Área de pico, s
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Preparación de disoluciones patrón
Obtención de sus cromatogramas
columna se basa en la
comparación de la altura, o del
área, del pico del analito con la
de uno o más estándares
•Equipos modernos: integración
del área

28. Método consiste en introducir en cada disolución estándar, así como en la
muestra, una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar, a la que
se llama patrón interno. La relación entre las áreas (o alturas) del analito y del
estándar interno, es el parámetro que representado frente a la concentración de
analito, origina una línea recta, cuya ecuación permite calcular la concentración
de analito en la muestra.

29. 29

31. Cromatografía de gases

32. 32
Cromatógrafo de Gases

33. 33
Principales componentes
☯Gas de acarreo
☯Controladores de flujo
☯Inyectores
☯Columnas
☯Detectores
☯Sistema de datos

34. Gas de acarreo
 Portador o fase móvil, es el que transporta a los
compuestos a través de la columna.
 Químicamente inerte, puro (>99%), seco
Se aconseja colocar un filtro de carbón activo y una
trampa para humedad antes de la entrada del gas al
instrumento.
 El tipo de gas acarreador depende de la velocidad
requerida para el análisis y el tipo de detector a emplear.
 Los más utilizados son helio, nitrógeno, hidrógeno o una
mezcla argón con 5 % de metano.

35. Inyectores
En el puerto de inyección se lleva a
cabo la introducción de la muestra

37. Columnas
☛Es donde ocurre la separación y es el “corazón” de un
cromatógrafo.
☛Columnas empacadas de: cobre, aluminio, acero inoxidable,
vidrio ó teflón.
☛Columnas capilares de sílice fundida recubiertas con
poliimida.
☛El empaque puede ser un sólido, un líquido o un sólido
recubierto por un líquido.

38. Columnas cromatográficas empacadas
Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio.
Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm.
La longitud suele ser inferior a los 3 m.
Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias
que se quiere separar.

39. Columnas cromatográficas capilares
Se construyen con sílice fundida.
Los diámetros interiores suelen ser de 200-250
mm.
La longitud suele ser superior a los 20 m.
Hay dos tipos:
Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del
diámetro de la columna (micro-empacadas)
Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin
restricción por el centro de la columna

40. Ejemplos de fases estacionarias en
cromatografía de gases
Separaciones por punto de ebullición de compuestos
en un intervalo amplio de masas moleculares:
Escualano
Polidimetilsiloxano
Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos
polidifenildimetilsiloxano
policarboranometilcianoetilsilicón
Para compuestos nitrogenados
poliamida
policianoetilmetilsilicon
Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos
polietilenglicol
pentaeritritol tetracianoetilado

41. HORNO
• Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en un
soporte y se introducen en el interior de un horno
• El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente
• La temperatura se debe poder programar para poder trabajar en
régimen de gradiente
• Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requieren
comenzar a temperaturas por debajo de la ambiental

42. Detector de Ionización a la Llama (FID)
Consiste de una llama de
hidrógeno-aire y una placa
colectora. El efluente de la
columna pasa a través de la llama,
que ioniza las moléculas
orgánicas.
Los iones se recogen en un
electrodo de polarización
negativa y producen una señal
eléctrica.
El FID es extremadamente
sensible y es el detector más
ampliamente utilizado, su
desventaja es que destruye la
muestra.

43. Detector de Espectrometría
de Masas, MSD
*El espectrómetro de masas
usa la relación masa-carga
(m/z) de moléculas ionizadas.
*Es una técnica muy poderosa
que permite cuantificar,
identificar y da información
acerca de la estructura de
compuestos desconocidos.

44. Detector-analizador de masas
*La operación general del espectrómetro de masas es:
a) crea iones en fase gaseosa
b) separa los iones en base a su relación (m/z).
c) mide la cantidad de iones de cada relación (m/z).
Una vez ionizadas las moléculas, estas pasan al analizador de iones el
cual los transporta hacia el detector: Existen diferentes tipos de
analizadores los que son utilizados de acuerdo a las necesidades.
Dentro de los analizadores podemos citar, la trampa de iones, el
sector magnético, el tiempo de vuelo, el cuadrupolo, etc.

45. El cuadrupolo consiste de cuatro cilindros metálicos paralelos, en
donde dos de ellos tienen un potencial (U + Vcos(wt)) y los otros dos
–(U + Vcos(wt)), lo que le da un rango de frecuencia, los iones con
cierta relación (m/z), pasan a través del cuadrupolo, los que no son
eliminados. En este sistema se necesita un alto vacío, para el
transporte de los iones a través del analizador (10-9 torr).

48. El HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) o CLAR (Cromatografía
Líquida de Alta Resolución) es el método más
moderno para realización de cromatografías.
La cromatografía es un método, usado
primariamente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.

49. Diferencias. Fase Móvil
Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.
Si es un líquido: Cromatografía líquida.
•Cromatografía en capa delgada
•Cromatografía líquida en columna abierta
•HPLC

50. Sistema HPLC
HPLC Solvent
Reservoirs
Rheodyne
Injector
HPLC
Column
9010 Solvent
Delivery System
9050 Variable
UV/Vis Detector
9060 Polychrom
(Diode Array) Detector Computer
Workstation

51. 51
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
(PARTES DE UN HPLC)
Desgasificador
de disolventes
Abastecimiento
de disolvente
Filtro
Bomba de
alta
presión
Válvula de
seguridad y purga
Espacio térmico
Columna analítica
Lectura
Amplificador
Recolección
o descarga
Descarga
Gases
disueltos
Jeringa o válvula para la
muestra
Introducción de la
Preco- muestra
lumna
Medidor
de presión

52. %A %B %C Flow Rate Pressure
{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)
Varian 9010 Solvent Delivery System
through
pulse
dampener
Rheodyne
Injector
Column
Ternary Pump
from solvent
reservoir
to
detector
through pump
to column
to injector

53. UV Spectrum
Chromatogram
Varian 9060
Polychrom Detector
Reset
Ready
UV Spectrum
{shows full UV abs.}
UVmax UVmax
Chromatogram
{shows peaks, Rt}
ABS.
Time
ABS.
Wavelength
Rt Rt

54. HPLC Chromatograms
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (minutes)
Rt = 3.0 min.
faster moving
less retained
Rt = 5.2 min.
slower moving
more retained
Absorbance 
Approximation
of peak area by
triangulation
Area = base x height
2
base
height
Peak A Peak B

55. Chromatography Stationary Phases
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH
| | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH
| | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
relatively polar surface
Derivatized Silica Gel
relatively nonpolar surface
Silica Gel
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR
| | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR
| | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
Where R = C18H37
hydrocarbon chain
(octadecylsilyl deriv.
silica or “C18”)
“normal phase” “reversed phase”

56. Hay dos tipos de fases estacionarias:
Fase Normal: el componente principal de la fase estacionaria es
muy polar(ej. silice) y la fase móvil es poco o medianamente
polar. Bajo estas condiciones los compuestos poco polares
eluyen primero
Fase Reversa: La fase estacionaria es poco polar, normalmente silica
tratada (siloxano) con R de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37 carbonos
(C-18 o n-octildecil). La fase móvil es polar y en estas condiciones los
compuestos menos polares son mas retenidos, eluyendo primero
los más polares junto con la fase móvil

57. 57
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES
Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis
Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección
(hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de
masas o plasmas..etc)
La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o
fácilmente volatilizables.
El resto de muestras que no poseen esas características pueden
ser analizadas por HPLC.
Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades
que ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten
abordar análisis de multicomponentes en muestras de diversa
procedencia, con elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del
detector).

58. EJEMPLO CG
58

59. AgradecimientoS
Senescyt (ecuador) a través del proyecto prometeo
Universidad técnica de machala: institución de vinculación