La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o qPCR es un método de amplificación y detección de ácidos nucleicos que permite cuantificar de forma precisa y rápida una secuencia de ADN o ARN objetivo. Se basa en la detección y cuantificación de un fluoróforo a medida que se van formando los productos de PCR en cada ciclo, lo que permite determinar la cantidad inicial de la secuencia diana. Tiene aplicaciones en diagnóstico molecular, investigación básica y control de patógenos y organismos gené

1. qPCR
Keny Davi Alvarado Quiroz

2. Reacción
de
amplificación
Método
de
detección
Fluorocromo
Producto
Formado
Cinética
de
la
Reacción
Alta
especificidad
Alto
rango
de
detección
Rápida
No
electroforesis

3. Termociclador
Fluorómetro
•Lampara de Tungsteno
•Resistencia
•Laser
•Filtros
•Multiplicadores
•Fotodetectores
Hardware y
Software
•Análisis de Datos

5. Agentes
intercalantes
Fluorescentes
Sondas específicas
•TaqMan
•LUX Primers

6. Bajo
costo
Unión
dsDNA
Inespecífico
Diseño
cuidadoso
Primers
Desventajas
No es posible
hacer
reacciones
múltiples
Dímeros
Menos
preciso
Método
de
Cuantificación
Obligatorio
Verificar la
especificidad de
la señal
Analizar la
curva de
disociación
Comprobar
señal
•Amplificación del
blanco

8. Sonda 2
Fluoroforos
5’
• Reportero
3’
• Silenciador
Hibrida
Cadena
molde
Amplificación
Acción ADN
polimerasa
DNA
polimerasa
AmpliTaq
Gold
• Hot inicial

10. Flourescence
Resonance
Energy
Transfer
Transferencia de energía entre dos
fluoróforos
un donador
(reportero)
Alta energía
un aceptor
(apagador o
quencher)
Baja energía
Unidos
No
fluorescencia
Separados
Alta energía
Produce
Fluorescencia

11. Un primer
fluoróforo
Hibrida
DNA molde
Fluoróforo
excitado
DNA
polimerasa
Taq
Platinum
Hot
Inicial

13. UNG (Uracil-N-glicosidasa
•Previene contaminación
Fluoróforo ROX
•Normaliza Fluorescencia

14. Fluoróforo de
acuerdo al
equipo
Equipo
calibrado
Superficies
limpias
• Guantes sin polvo
• Papel sin pelusa
• Hipoclorito 10%

16. •Curvas paralelas
Establecer
Umbral
•Primera curva
cruza umbral
•3 ciclos
anteriores
Establecer
Línea Base
•Automático o
Manual
•Curva calibración
•Regresión lineal
•Ct
Analizar
los datos

18. Cycle threshold
Ciclo Umbral
N° ciclos necesarios curva alcance umbral en fluorescencia
Inversamente proporcional a la cantidad inicial de DNA
Discrimina comportamiento muestras
Ct depende características de Equipo Lector

20. Método comparativo de Ct (2ΔΔCT)
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Relativa

21. Determinar
cargas virales,
la presencia de
agentes
patógenos y
transgénicos
Se requiere una muestra con una
cantidad exacta
Estándares
Curva de
calibración
Interpolar
directamente
los valores de
Ct de las
muestras
problema
Concentración.

22. Ensayos de
expresión
génica
Misma
muestra
Cambios de
un gen de
interés
Diferentes
condiciones
Punto de
Partida (gen
Constitutivo)
No necesita
un grupo de
muestra

23. Calcula los cambios de
expresión génica
Células o
Tejidos
Referencia
Usando
diluciones
seriadas
Amplificación
gen blanco
gen
endógeno
Productos
de la PCR
pequeños
(150 pb)

26. Investigación Básica
Diagnóstico Molecular
Monitoreo de
Patógenos
Monitoreo de OGM