Es útil para lo que estudian genetica

1. Biotecnología del ADN
Recombinante
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA
DE NICARAGUA
UNAN- León

2. "Nunca consideres el estudio
como una obligación, sino
como una oportunidad para
penetrar en el bello y
maravilloso mundo del
saber".
Albert Einstein

3. DNA
 Descubrimiento
 1869: se aisló por
primera vez DNA
 1944: se demostró que
el DNA contiene el
material genético.
 1953: se descubrió la
estructura de doble
hélice del DNA
 La estructura del DNA es
una doble hélice, formada
por cadenas orientadas en
direcciones opuestas
(antiparalelas).

4. INGENIERÍA GENÉTICA
 Técnica que consiste en la
introducción de genes en el genoma
de un individuo que carece de ellos.
 Conjunto de técnicas nacidas de la
Biología molecular, que permite
manipular el genoma de un individuo.

5. TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE
 Aislamiento y manipulación de
fragmentos de ADN de un organismo
para introducirlo en otro (ADN
recombinante).
 Permite obtener cantidades ilimitadas
que llevará el gen deseado.
 El gen deseado puede introducirse en
células de otros organismos
(vegetales, bacterias, animales) en
donde se expresará dicho gen.

7. Enzimas de restricción
 El clonamiento de genes requiere que el
DNA sea cortado en una forma muy precisa
y reproducible.

8. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Cada enzima de restricción reconoce una secuencia
nucleotídica específica en donde corta el DNA.
 Según el ataque, la enzima puede hacer un corte que
genere extremos romos ó bien cohesivos.
 La rotura del DNA produce una serie de características
de fragmentos y estos se pueden ligar a otros DNA,
como el vector de clonación

9. Aislamiento y manipulación de fragmentos
de ADN de un organismo para introducirlo
en otro (ADN recombinante)
Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiología
y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de
restricción y su aplicación en Genética Molecular)

10. La enzima Eco R1 corta en
la cadena del fragmento 1 y
el mismo tipo de corte en el
fragmento 2.
Estos cortes los realiza
cuando encuentra las
secuencias blanco.
Deja entonces dos
extremos complementarios
(pegajosos) que luego son
ligados por la ADN ligasa,
por último se obtiene un
ADN recombinante. El
análisis de la figura
justifica nuestro título de
tijeras moleculares.

12. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Corte cohesivo:
 Corte romo:

13. ACCIÓN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

14. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Molécula A Molécula B
Digestión de ambas moléculas con la
misma enzima de restricción, BamHI
Mezclar
Tratar con ADN-ligasa
ADN recombinante
Extremos
cohesivos

16. Secuencia Palindrómica

18. ACTIVIDAD DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

19. Enzimas de restricción

20. Molécula A Molécula B
Digestión de ambas moléculas con la
misma enzima de restricción, BamHI
Mezclar
Tratar con ADN-ligasa
ADN recombinante
Extremos
cohesivos

21. Vectores
 Los vectores de clonación son moléculas
transportadoras que transfieren y replican
fragmentos de ADN que llevan insertados.
 Para que sirva de vector, una molécula
debe ser capaz de replicarse junto con el
fragmento de ADN que transporta.

22. Vectores
 Plásmidos: moléculas de ADN circular
 Tienen su propio origen de replicación

23. Plásmidos
1
Plásmidos
2
Extremos cohesivos
Plásmido
3
Molécula de ADN recombinante
gen de resistencia
a la ampicilina

24. CÓSMIDOS
Son plásmidos que
contienen el fragmento de
ADN deseado que posee un
borde cohesivo procedente
del genoma del fago
lambda (extremo cos)y se
empaqueta en el interior
de un fago. Se construye el
cósmido uniendo los tres
elementos génicos, y el
resultado final es poder
introducir en la célula
receptora fragmentos
largos de ADN.

25. Plásmido

26. BACTERIÓFAGO
figura d figura e figura f

27. Además del origen de replicación, los vectores de clonación
deben llevar otros genes denominados marcadores, que
sirven para identificar las células que contienen el vector de
clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de
resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.
Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar
bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas
bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
Genes de luminiscencia. En este caso, la célula que contenga
el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz,
ya que el marcador que se le incorpora determina que se
exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la
célula hospedadora es una célula eucariota.

28. CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE
LEVADURAS
El cromosoma artificial de levaduras o YAC (Yeast artificial
chromosome) forma parte de los vectores de clonación de alta
capacidad siendo, de hecho, el de mayor capacidad (200 kb - 3.000
kb). Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack.
Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma
normal de una levadura (eucariota), portando
un centrómero y telómero terminales. Esto permite clonar en
levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta
un millón de pares de bases o más, al comportarse como un
cromosoma propio de la levadura.
Son utilizados en construcción genómicas, siendo muy extendido su
uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano. Sin embargo,
son más inestables que otros vectores como BACs (cromosoma
artificial bacteriano), que han acabado imponiéndose.
Los YAC tienen un origen de replicación relajado en procariotas, por lo
que aparecen muchas copias en cada bacteria (gran utilidad para
producir masivamente el vector), pero un origen de replicación
estricto en levaduras, apareciendo sólo una copia por célula de
levadura.

29. Transformación celular
 Introducción de DNA foráneo a la célula
 Etapa crítica para la obtención final de una
célula recombinante.
 Cada célula que capte el vector con el gen
clonado lo traspasará a la progenie, la que
también hará lo propio al reproducirse.
 En general, se habla de “transformación”
para procariontes y “transfección” para
eucariontes

30. TRANSFORMACIÓN CELULAR
 Es condición esencial que el medio
externo a la célula contenga un factor
que permita seleccionar a las que
incorporaron el material genético de
interés de las wild type

31. EXISTEN SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ENTRE LA
RECOMBINACIÓN EN LA NATURALEZA Y EN EL
LABORATORIO
1.Tanto la recombinación de ADN natural como la
efectuada en el laboratorio incluyen el intercambio
de ADN entre organismos, así como entre especies.
2.Las recombinaciones de ADN que ocurren de manera
natural suceden al azar y de manera no dirigida. En
general, algunos genes específicos no se mueven de
manera preferencial, y no hay algún “objetivo” que
dirija los movimientos del ADN. En las
recombinaciones de ADN en el laboratorio, se
mueven piezas específicas de ADN entre organismos
elegidos deliberadamente para lograr un objetivo
específico.

32. El esquema de esteEl esquema de este “dogma”“dogma” ha sido encontrado repetidamenteha sido encontrado repetidamente
y se considera una regla generaly se considera una regla general (salvo en los retrovirus)(salvo en los retrovirus)
Proteína

33. TECNICAS
La PCR ha revolucionado el diagnóstico virológico. Se han
empleado diferentes protocolos, de los cuales se destacan
aquellos que detectan la presencia del gen que codifica la
envoltura viral o alguno de los genes que codifican las
proteínas no estructurales. La PCR anidada (nested /PCR),
de mayor sensibilidad es ampliamente utilizada.
Recientemente, se han impuesto sistemas más sensibles que
permiten detectar y cuantificar el ácido nucleico viral presente
en el suero aun en presencia de un bajo número de copias. La
PCR en tiempo real ha sido aplicada con éxito en la detección y
cuantificación de dengue en muestras de suero y linfocitos de
sangre periférica. El ensayo se realiza en un solo vial lo que
disminuye las posibilidades de contaminación, la señal que se
produce en las muestras positivas se monitorea en tiempo
real, esto permite a su vez la cuantificación del ácido nucleico.

34. Principio del PRC
 No es una técnica analítica per. se, es una metodología,
resultante de la aplicación práctica de tres conceptos.
 Ciclo del PCR
 Cada ciclo de una PRC, consta de tres etapas:
 Desnaturalización:
 Calentamiento para la separación de las dos hebras del
ADN mediante una incubación breve (30-120‘s) a una
temperatura entre 68 y 97˚ c que debe ser superior a la
de fusión de la región de ADN que se requiere amplificar.

35. Elongación:
 Etapa de amplificación (72-75˚C, 1-3 min.)
en la que el ADN polimerasa termoestable
elonga los cebadores, empleando como
molde ambas hebras originales. La
replicación transcurren dirección 5`--3´ a
partir del extremo 3´- OH de cada cebador,
empleando como sustrato los cuatro dNTPs,
hasta terminar la lectura del molde o hasta
que comience una nueva etapa de
desnaturalización

36. Templado:
 O hibridación enfriamiento rápido por
debajo de Tm de forma que se permite la
hibridación de las hebras sencillas del ADN
de interés con los oligos cebadores, con
temperaturas de 37 a 65˚ C que se
mantienen entre 10 y 120’s.

37. METODOS DE EXTRACCION DE DNA
• Método fenol-cloroformo
• Método del acetato de potasio
• Método del acetato de potasio
modificado
• Método de bromuro de cetil-trimetil
amonio

38. Observa el siguiente video
youtube: http://www.youtube.com
/watch?v=V9PtQlp-e7g
APLICACIONES DE LA TÉCNICA PCR
Investigaciones génicas: Clonación de genes
Detección de clones recombinados
Estudio de ADN de fósiles
Medicina: Exploración de enfermedades génicas
Diagnóstico prental
Detección del reordenamiento de tumores ancerosos.
Microbiología e Infectología: Identificar ADN de virus, parásitos
y bacterias.
Detectar la presencia de agentes infec-
ciosos(herpes virus, virus del SIDA, vi-
rus de la hepatitis).
Medicina forense y Criminalística:
Determinación de maternidad y paternidad
Análisis en casos de violación y asesinato.

39. APLICACIONES DEL PCR
 Clonación Celular de los Fragmentos de ADN
 Detección de secuencias sin purificación previa
 Secuenciación de ácidos nucleicos
 Establecimiento de polimorfismo de secuencia
 Rastreos de mutaciones
 Tipado de ADN para transplantes
 Diagnostico de enfermedades genéticas
 Resolución de problemas forenses
 Estudio Evolutivo
 Detección de microorganismos infecciosos
 Detección de Células Tumorales
 Amplificación de DNA para su poder de clonación celular

40. Es un proceso cíclicoEs un proceso cíclico
(cada ciclo consta de 3 pasos)(cada ciclo consta de 3 pasos)
94ºC desnaturalización (separación94ºC desnaturalización (separación
de las dos hebras dede las dos hebras de ADNADN))
50ºC Anillamiento de "cebadores"50ºC Anillamiento de "cebadores"
72ºC copia de cada una de las72ºC copia de cada una de las
hebras dehebras de ADNADN por lapor la ADNADN
polimerasapolimerasa
En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por
este descubrimiento
35 ciclos 236
= 68 billones de copias

41. La electroforesis en gel es un grupo de
técnicas empleadas por los científicos para
separar moléculas basándose en propiedades
como el tamaño, la forma o el punto
isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza
generalmente con propósitos analíticos
http://www.youtube.com/watch?v=eauONOJ3F00
Electroforesis en gel

42. Electroforesis
 Capacidad de las macromoléculas para deslazar en
Un campo eléctrico, con velocidad proporcional a su
carga E inversamente a su tamaño.
 TIPOS :
 Electroforesis de campo punzante
 Electroforesis de frente móvil o libre
 Electroforesis en gel
 Electroforesis capilar

43. TIPOS Y PREPARACION DE GELES
• Gel de Silic
•Gel de Poliacrilamida
El gel de sílice es una forma granular y porosa
de dióxido de silicio hecho a partir de
Silicasódico.
se utiliza para reducir la humedad en espacios
cerrados; normalmente hasta un 40%.
Proceso de preparación del gel de
Poliacrilamida
La preparación del gel de Poliacrilamida consiste fundamentalmente en
disolver en agua una mezcla de Acrilamida y Bis-Acrilamida en una
determinada proporción.

44. que es función del grado de reticulación deseado en el
polímero, y añadir Urea, Amoniopersulfato (APS) y
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED). La función
de la Urea es servir de desnaturalizante, mientras que
el APS y el TEMED actúan como catalizadores y la Bis-
Acrilamida como co-monómero. Un ligero
calentamiento hasta unos 45 ºC favorece la disolución y
acelera el comienzo de la reacción de polimerización. A
continuación se vierte mediante la jeringuilla la mezcla
así preparada entre placas de vidrio con una separación
prefijada y se deja polimerizar, obteniéndose un gel del
espesor deseado. El TBE es un tampón habitual
compuesto de TRIS, Ácido Bórico y EDTA.

46. La segunda parte del núcleo, gel se refiere a la matriz usada para
separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero
entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es
de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o
ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes
concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la
polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes
tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos
centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. En
ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La
acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotóxica y
debe ser manejada cuidadosamente para evitar envenenamientos.
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza
electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través
del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de
potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes
velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia
el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los
electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica)

47. Secuenciación automática
ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC
AGTGACTTTGTCCAAC
GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCC
AGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT
ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA
Secuenciación
de genomas

48. http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8
Técnica de SOUTHERN BLOT

49. ADN RECOMBINANTE
 La tecnología del DNA recombinante ha
hecho posible investigar más a fondo la
estructura y función de los genes,
especialmente de los genes eucarióticos que
eran inaccesibles por otros métodos. Estas
investigaciones permanentemente generan
nuevos interrogantes e inquietudes, muchos
de los cuales tienen profundas implicancias
éticas.

50. ADN RECOMBINANTE
 Transformación de bacterias y localización de un segmento
de DNA de interés por medio de una sonda radiactiva

51. LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECORI ESCINDE ESTE
PLÁSMIDO EN LA SECUENCIA GAATTC,
DEJANDOEXTREMOS "PEGAJOSOS" EXPUESTOS.

52. REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA

53. CLONACION

54. CLONACION
 Se define como la tecnología para producción de
individuos genéticamente idénticos. Es un sistema de
reproducción en la que no participan ovocitos y
espermatozoides en la formulación genética, sino
que la carga genética contenida en el ADN de los
cromosomas es provista por células somáticas. Se
han utilizado diferentes tipos de células, de origen
embrionario, fetal o diferenciado de animales
adultos, que transferidas a ovocitos enucleados
producen un nuevo individuo genéticamente idéntico
a la célula donante. Este tema expone los métodos
básicos de la tecnología del DNA recombinante que
se utilizan para aislar, replicar y analizar Los tejidos

55. CELULAS MADRE

56. (f)
(h)
(g)Ciclo líticoCiclo lítico
Ciclo lisogénicoCiclo lisogénico

57. Genoma de hongos: 44 millones de pares de bases
Huesped: Escherichia coli
Vector: Bacteriófagos
capacidad: 20 mil pares de bases
Genoma humano: 3000 millones de pares de bases
Huesped: Saccharomyces cerevisiae
Vector: YAC (cromosoma artificial de levadura)
MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de
bases)

58. •Detección de mutaciones
Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación
puntual)
•Secuenciación de ADNs fósiles
Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas
copias (la mayoría
están dañadas o degradadas)
•Diagnóstico de enfermedades genéticas
Diagnóstico prenatal / Diagnóstico pre implantación de
enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto
previamente a su implantación en procesos de
fecundación in vitro
•Identificación de especies y control de cruces
entre animales
Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una
especie más
barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de
especies en peligro
•Secuenciación de genomas
Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el
genoma humano)

59. Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...
(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían
a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

60. Obtención de vacunas recombinantes
(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)
La levadura fabrica las
proteínas víricas
con poder inmunológico
Inyección de proteínas
víricas en un chimpancé
plásmido
bacteriano
Integración del
plásmido híbrido
en el núcleo de una
célula de levaduraADN
Extracción del ADN
del virus

61. Conocimiento previo
de la secuencia de
ADN enfermo
Mediante ingeniería
genética se construye
una sonda de ADN,
marcada (marcaje
fluorescente), con la
secuencia
complementaria del
ADN enfermo
ADN
enfermo
ADN
sano
ADN complementario
del ADN enfermo
Diagnóstico de enfermedades de origen genético
ADN de la
persona que
se quiere
diagnosticar
¿Hibridación?
¿No
hibridación?
Renaturalizac
ión del ADN
con la sonda
fluorescente
Desnaturaliza
ción del ADN
Si aparecen
bandas
fluorescentes
demuestra que
la persona
presenta la
anomalía
Biochip
Microarray
DNAchip
DIAGNÓSTICO