Este documento describe las tecnologías del ADN recombinante. Explica que estas técnicas permiten fragmentar y unir ADN usando enzimas de restricción y ligasas. También describe cómo los fragmentos de ADN se insertan en vectores de clonación como plásmidos y se transfieren a células huésped para su replicación, lo que permite aislar grandes cantidades de ADN específico. Finalmente, explica algunas aplicaciones de estas tecnologías en investigación médica, como la producción de proteínas terapéuticas

1. Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla
Licenciatura en Biomedicina
DHTICS
Maestra: María Verónica González Tapia
Ensayo: ‘‘Tecnologías del ADN
recombinante’’
Alumna: Miranda Herrera Urióstegui

2. Introducción
El avance en el conocimiento de los numerosos métodos naturales mediante los cuales las
células procesan, añaden, eliminan y transfieren información genética abrió el camino a la
comunidad científica para el desarrollo de manipulaciones genéticas. En los últimos años,
se han desarrollado técnicas que han permitido abordar el análisis y la manipulación del
ADN en una forma antes inimaginable
Esta técnica reposa sobre la observación de la recombinación del ADN in – vivo durante la
conjugación y la transformación en el mundo de las bacterias.
Está regida por tres premisas fundamentales:
• Lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN.
• Recorte de ADN con las enzimas de restricción y el ligamento de los restantes fragmentos
de ADN con otras enzimas.
• Localización de vectores de clonación.
Las secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios:
• Por síntesis química.
• Por copia del ARN mensajero, una enzima llamada transcriptasa inversa, aislada de
ciertos virus (los retrovirus, en los que el genoma está constituido por ARN) es capaz de
copiar bajo la forma de ADN tanto una secuencia de ADN como de ARN. Puede, a partir
de una secuencia de ARN mensajero, formar una cadena de ADN complementaria. La
manera más corriente de clonar este ADN complementario es hacerlo copiar por un ADN
polimerasa o transcriptasa para así obtener un ADN de doble cadena. Se deberán formar
cortes colgantes para facilitar su inserción posterior por alguno de los tres procedimientos
siguientes:
• Partiendo el ADN por una enzima de restricción.
• Adicionando colas de una serie de desoxinucleótidos idénticos formando una sola cadena
a cada lado del ADN.
• Adicionando sitios de restricción obtenidos por síntesis orgánica.
La tecnología del ADN recombinante y, en general, la Biología Molecular, ha hecho
posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los
genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Pero esta tecnología también ha
permitido “combinar” genes de distintos individuos y especies, generando organismos
genéticamente modificados (transgénicos) que generan nuevos interrogantes e inquietudes
científicas, además de profundas implicaciones éticas.

3. Cuerpo
Generalidades del ADN recombinante
Desde la creación de la genética y hasta antes de 1953, los genes fueron considerados
entidades abstractas de información, que determinaban características de morfología y
función en un organismo. Eran unidades independientes que se trasmitían generación tras
generación, siguiendo principios mendelianos y otros patrones de herencia. Esta perspectiva
limitaba la genética al estudio de caracteres hereditarios, como color de semillas, longitud
de tallos, color de ojos, pigmentación de la piel, hemofilia, anemia falciforme y otros.
En 1953, la publicación de la estructura del ADN por Watson y Crick fue el evento
trascendental que transformó a la genética desde su fundamento. El conocimiento de la
estructura del ADN marcó el rumbo de la investigación hacia la codificación y la expresión
de información genética, que subyacen a los mecanismos de la herencia. El descubrimiento
de que los genes son ADN significó la sorprendente posibilidad de manipular el material
genético, exactamente igual que como se hace con cualquier otra molécula, y fue el inicio
de la tecnología del ADN recombinante.
ADN recombinante es una molécula de ADN, cuya estructura resulta de haber modificado
ADN de dos o más fuentes.
La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los
ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus.
Herramientas para fragmentar y ligar ADN.
La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de
poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de
secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:
1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas
de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas
específicas.
2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a
otras moléculas de DNA que sirven de vectores.
Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la
manipulación de la molécula de DNA recombinante recién creada.
3. La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de
DNA insertado, se transfiere a una célula huésped.

4. Dentro de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas
de copias idénticas conocidas como “clones”.
4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA
recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia
clonada.
5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse
y analizarse.
6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el
producto génico puede aislarse y examinarse.
El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la
investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que codifican
genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión
génicas.
Si bien la ruptura del ADN puede ser realizada mecánicamente, por este medio la
fragmentación se produce al azar. La obtención de fragmentos específicos fue posible
mediante un método desarrollado a partir del uso de las endonucleasas o enzimas de
restricción.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en
algunos bacteriófagos. Escinden las moléculas de ADN en secuencias de reconocimiento
específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las
células bacterianas es degradar moléculas de ADN extrañas. El ADN de la bacteria se
protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las
secuencias de reconocimiento. Digiriendo un genoma o parte del mismo con estas
herramientas permite realizar “mapas de restricción”.
Algunas enzimas de restricción producen cortes rectos, liberando fragmentos con extremos
romos, mientras que otras cortan de forma escalonada, dejando extremos cohesivos
o ligables, que pueden unirse por complementariedad de bases a otro fragmento distinto
pero cortado por la misma enzima. El uso de la ADN ligasa puede unir estos extremos
cohesivos de dos fragmentos distintos.
Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron,
utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII
se descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas de restricción:
• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta
distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

5. • Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la
molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan
ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios
específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas
(“palindrómicas”), es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' a 3' es
la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' a 3'.
Vectores
Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a
entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente,
moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener
unas determinadas características:
1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que
transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez
en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan
para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.
3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos
o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células
huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos y
los cósmidos.
Identificación de secuencias clonadas específicas
Paseo cromosómico
En algunos casos, cuando se conoce la localización aproximada de un gen, es posible clonar
dicho gen clonando primero las secuencias vecinas.
A menudo, las secuencias vecinas se identifican por análisis de ligamiento. Estas
secuencias sirven de punto de partida para el paseo cromosómico, el aislamiento de clones
adyacentes de la biblioteca genómica. En un paseo cromosómico, se subclona el fragmento
final del DNA clonado, y se utiliza como sonda para recuperar clones solapados de la
biblioteca genómica.
Los clones solapados se analizan por mapas de restricción para determinar la extensión del
solapamiento. Un fragmento de uno de los extremos de este clon solapante se utiliza como

6. sonda para recuperar un nuevo conjunto de clones solapados, repitiéndose el proceso de
análisis. De esta manera, es posible “pasear” por el cromosoma, clon a clon. El gen en
cuestión puede identificarse secuenciando los nucleótidos del clon recuperado y buscando
una fase abierta de lectura (ORF), un trecho de nucleótidos que empieza con un codón de
iniciación y que tiene una serie de codones que codifican aminoácidos, seguido de uno o
más codones de terminación. Aunque es laborioso y lento, el paseo cromosómico se ha
utilizado para recuperar genes asociados a enfermedades genéticas humanas; los genes de la
fibrosis quística y de la distrofia muscular se aislaron con esta técnica.
En los complejos genomas eucarióticos, hay varias limitaciones al paseo cromosómico. Si
una sonda contiene una secuencia repetitiva, hibridará con muchos otros clones de la
biblioteca genómica, muchos de los cuales no serán segmentos adyacentes, terminándose el
paseo. En estos casos puede utilizarse una técnica relacionada denominada salto
cromosómico, que pasa por alto la región que contiene secuencias repetitivas y continúa el
paseo.
Método de análisis de secuencias clonadas
Tras la clonación de un fragmento de ADN, existen dos métodos para conocer su secuencia.
En la secuenciación de un segmento de una molécula de ADN por el método
de Maxam y Gilbert, el segmento de cadena simple se marca radiactivamente (o con sondas
alternativas desarrolladas en los últimos años para evitar los riesgos radiactivos) en el
extremo 5'. El ADN marcado se divide en cuatro porciones, cada una de las cuales se
somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas en una sola de las
cuatro bases nitrogenedas.
Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en
un gel de poliacrilamida desnaturalizante, en el que se separan fragmentos que difieren
incluso en un nucleótido de longitud. Combinando la información obtenida con cada
reacción, se puede inferir la secuencia del segmento completo.
En la secuenciación por el método enzimático, se procede en varias etapas. En una primera
etapa, el oligonucleótido cebador marcado radiactivamente se aparea con el ADN de simple
cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la
ADN polimerasa. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4
tubos, cada uno de los cuales contiene 3 desoxinucleótidos, y además, uno de los
nucleótidos terminadores (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP).
Estos son didesoxinucleótidos carecen del OH- en la posición 3’, por lo que, una vez que
son agregados, no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman en el
último nucleótido de la cadena. En una segunda fase, se realiza una electroforesis de los 4
tubos y se localizan los fragmentos por tamaño, desde 1 hasta el total de nucleótidos.
Sabiendo que el último nucleótido de ese fragmento es el ddNTP del tubo en el que se haya
sintetizado, se puede leer la secuencia completa del fragmento.
Aplicaciones de las tecnologías de ADN recombinante

7. Aplicaciones en investigación y medicina.
Es evidente que la producción de proteínas de utilidad médica como la somatostatina, la
insulina, la hormona del crecimiento humana y los interferones, es de gran importancia
práctica. Por ejemplo, en el pasado, la hormona del crecimiento humana para el tratamiento
del enanismo hipofisario se extraía de hipófisis obtenidas durante las autopsias y estaba
disponible sólo en cantidades limitadas. La interleucina-2 (una proteína que ayuda a regular
la respuesta inmunitaria) y el factor VIII de la coagulación se han clonado con éxito, y sin
duda en el futuro se producirán otros importantes péptidos y proteínas. Un avance
especialmente interesante es el uso de maíz y soja transgénicos para producir anticuerpos
monoclonales para uso médico. También puede ser posible utilizar plantas desarrolladas
mediante ingeniería genética para producir vacunas orales.
Podría estudiarse cualquier individuo para detectar la presencia de genes mutantes con
sondas y técnicas de hibridación (incluso antes del nacimiento si se utilizaran en conjunción
con la amniocentesis). Puede ser posible aplicar a sujetos enfermos un tipo de cirugía
genética denominada terapia génica de células somáticas. Por ejemplo, sería posible retirar
las células de un sujeto con una enfermedad genética, cultivarlas y transformarlas con DNA
clonado que contuviera una copia normal del gen o los genes defectuosos. Estas células
podrían entonces volver a introducirse en el paciente; si se establecieran, la expresión de los
genes normales podría curar al sujeto.
Puede ser posible utilizar un retrovirus defectivo u otro virus para insertar directamente los
genes adecuados en células huésped, quizá incluso en órganos o tejidos específicamente
preseleccionados. Las toxinas de fusión proporcionan un tercer ejemplo de aplicaciones de
ingeniería genética potencialmente importantes. Las primeras toxinas desarrolladas han
sido proteínas recombinantes en las que se han combinado los dominios catalítico y de
translocación de membrana de la toxina diftérica con proteínas que se unen específicamente
a los receptores de superficie de la célula diana.

9. Conclusión
Los avances en la tecnología del ADN recombinante han conseguido aislar genes
específicos, cortar ADN en regiones predeterminadas, unir diversos fragmentos de ADN
sin importar secuencia ni origen, hacer mutaciones en sitios específicos, insertar en el
genoma de un organismo fragmentos de ADN de otra especie, clonar organismos
transgénicos, secuenciar genomas completos y muchos otros tipos de manipulaciones más.
Con la genética como plataforma, el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante dio
origen a dos campos científicos: la ingeniería genética y la genómica.
Las técnicas de DNA recombinante están desempeñando un papel de importancia creciente
en la investigación de las bases moleculares de la enfermedad. La transferencia de la
investigación a la aplicación práctica a menudo es un proceso lento, debido a que no resulta
fácil tratar la enfermedad de forma eficaz si se desconoce su mecanismo molecular. Por
este motivo está nueva tecnología puede participar en la lucha contra una enfermedad
aportando nueva información sobre su naturaleza, además de contribuir al diagnóstico y a
tratamiento.