Este documento resume los principales conceptos y procesos de la ingeniería genética. Explica cómo se manipula el ADN mediante enzimas de restricción para fragmentarlo y unirlo a vectores como plásmidos. Luego se introduce este ADN recombinante en huéspedes como bacterias para su clonación y amplificación. Finalmente, se describen técnicas como Southern y PCR para identificar y amplificar genes de interés.

1. B I O T E C N O L O G Í A Ingeniería genética

2. BIOTECNOLOGÍA Visión general : En la práctica : Utilización de los seres vivos para beneficio humano La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Producción de alimentos y bebidas Obtención de medicamentos Clonación, mapas genéticos, Organismos transgénicos, terapia génica

3. INGENIERÍA GENÉTICA Tecnología de ADN recombinante Clonación y expresión de genes Aplicaciones

4. PROCESO…(ADN recombinante) Fragmentar y aislar el ADN Unión a vectores. Introducción en las células. Clonación Búsqueda del clon idóneo. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern, Secuenciación. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

5. FRAGMENTACIÓN DEL ADN Por endonucleasas de restricción Las enzimas de restricción , también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa , para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

6. ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS Generan extremos cohesivos. Si se actúa sobre dos ADNs diferentes con la misma endonucleasa, al juntarlos se unirían espontáneamente.

7. IMÁGENES DE ACCIÓN ADN ENDONUCLEASAS

8. EN DETALLE…

9. MAPA DE RESTRICCIÓN Mapa físico de un segmento de ADN que muestra los lugares de corte de endonucleasas específicas y la distancia entre pares de bases. Indica puntos de corte Se reflejan determinadas secuencias de nucleótidos. Permite comparar ADNs y ver su similitud (detección de mutaciones)

10. EJERCICIO 1 Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por separado con dos endonucleasas de restricción y luego con una mezcla de ambas obteniéndose los fragmentos indicados a continuación : Endonucleasa de restricción Tamaño de los fragmentos (Kb) EcoRI 3.0 y 4.0 HaeIII 2.0 y 5.0 EcoRI + HaeIII 2.0 , 1.0 y 4.0

11. EJERCICIO 1 - Solución

12. APLICACIÓN MAPA RESTRICCIÓN Permite diferencias ADNs de individuos de diferentes especies. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP) (cada individuo tiene diferente colección de fragmentos para la acción de una misma colección de endonucleasas)

13. 2. UNIÓN A VECTORES Los vectores deben ser tratados con las mismas endonucleasas de restricción. Luego se produce la unión del vector con el fragmento de ADN a introducir. Los vectores son estructuras que permiten introducir material genético en el interior de otra célula.

14. PLÁSMIDOS Son moléculas de ADN circular e bacterias. Tienen replicación independiente. Además, otros genes Facilidad para la manipulación. Porta marcadores específicos: permiten diferenciación posteror.

15. IMAGEN DE UNIÓN PLÁSMIDO

16. FAGOS Virus que infectan bacterias (bacteriófagos) Transducción: incorporan material genético del huesped. Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huesped. Ej. Bacteriofágo o fago  .

17. FAGO LAMBDA Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante. 48,502 pares de bases de longitud. Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado. CICLO DE UN VIRUS

18. CÓSMIDOS Fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y el sitio COS. (similares a plásmidos) Sitio COS: provoca el empaquetamiento del ADN. Conclusión: permite transportar grandes cantidades de ADN.

19. OTROS Cromosomas artificiales de levadura: YACs Retrovirus Cromosomas humanos artificiales: HACs

20. RESUMEN VECTORES

21. 4. CLONACIÓN Sacar copias del ADN que se ha unido al vector. Se utiliza un huesped: Capacidad de crecimiento rápido. No ser dañino o patógeno Ser capaz de aceptar el ADN exógeno y que éste permanezca estable. El huésped debe tener enzimas para la replicación del vector. Bacterias: E. coli y B. subtillis .

22. Escherichia coli como vector Potencialmente patógeno Producción de endotoxinas.

23. CLONACIÓN EN EUCARIOTAS EL más utilizado Saccharomyces cerevisiae. Es capaz de recibir plásmidos. También YACs (cromosomas artificiales de levadura) Cultivos celulares de mamíferos: Manejo parecidos a huéspedes bacterianos. Ventaja: tienen proceso maduración del ARNm y así ya es directamente funcional. Desarrollo de las inteligencias

24. UTILIZACIÓN DE YACs

25. 5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO Hay muchos tipos de bacterias transformadas. ¿Cuál tiene el fragmento de ADN exógeno que nos interesa? Se saca réplica en membrana. Se desnaturaliza ADN con NaOH.

26. 5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO Se desnaturaliza el ADN con NaOH. Se añade sonda radioactiva: complementaria al gen que se quiere buscar. Se lava el ADN monohebra (sólo queda el híbrido) Se pone placa fotográfica. Desarrollo de las inteligencias Biblioteca genómica

27. APLICACIÓN MÉDICA OBTENCIÓN DE LA INSULINA

28. 6. IDENTIFICACIÓN DE GENES - Southern Es un mecanismo mediante el cual se pueden identificar genes que se encuentren en fragmentos de restricción. Aplicación: Diagnóstico de enfermedades Huella genética Concepto previo: electroforesis

29. ELECTROFORESIS EN GEL Gel de Agarosa (polímero de galactosa) Se ponen en “pozitos” en un extremos los fragmentos de ADN Se somete a un campo eléctrico (grupos fosfato son arrastrados al polo +) Fragmentos más grandes emigran menos. Los pequeños más.

30. MÉTODO SOUTHERN Electroforesis en gel (separación de fragmentos por tamaño) Desnaturalización (a ADN de cadena sencilla) Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los papeles secantes absorben el tampón y los ADN monohebra se pegan al filtro) Hibridación con sondas marcadas P 32 . Eliminación de sondas no unidas. Exposición a la película fotográfica y revelado Identificación de fragmentos V E R V E R 2

31. AMPLIFICACIÓN PCR Objetivo: obtener millones de copias en poco tiempo de fragmentos de ADN. Se basa en el enzima: , obtenida de Thermobacillus. Sólo se necesita conocer la secuencia de los extremos para fabricar cebadores. Tras varios ciclos se forman millones de copias.

32. AMPLIFICACIÓN POR PCR

33. POLIMERASA CHAIN REACTION Desarrollo de las inteligencias

34. CADENA DE REACCIÓN DE LA POLIMERASA - 1

35. PCR 2

36. CICLO DE UN VIRUS

37. SOUTHERN

38. Método southern

39. Gracias por su atención . Desarrollo de las inteligencias