Este documento describe el desarrollo de un método de RT-PCR para detectar el virus de la leprosis nuclear de los cítricos (CiLV-N) en plantas de cítricos con síntomas en México. Se obtuvieron fragmentos de DNA viral a partir de muestras sintomáticas utilizando cebadores degenerados dirigidos contra el gen L de la polimerasa de rhabdovirus. Las secuencias mostraron similitud con el virus de la mancha de orquídea. Nuevos cebadores específicos diseñados para Ci

1. Detección de Citrus Leprosis Virus tipo nuclear
(CiLV-N) mediante RT-PCR en plantas de cítricos.
Alanís-Martínez, E. I.1
, Rojas-Martínez, R. I.2
, Otero-Colina, G.2
, Robles-García, P.
L.3
,1
ENECUSAV-SENASICA. 2
Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados,3
Dirección General de Sanidad Vegetal, SENASICA. iobanaa@yahoo.com.mx

2. Detección de Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N) mediante RT-PCR en plantas de cítricos.
Alanís-Martínez, E. I., Rojas-Martínez, R. I., Otero-Colina, G., Robles-García, P.
XV Congreso Internacional y XL Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. (SMF)
ANTECEDENTES
•La leprosis de los cítricos es una enfermedad endémica de varios países de
Sudamérica que se ha diseminado considerablemente hacia el norte
(Bastianel et al., 2010).
•Es considerada una de las enfermedades más destructivas que afectan a los
cítricos en América (Rodrigues, 2003 ).

3. Tomado de “SISTEMA NACIONAL DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA FITOSANITARIA (SINAVEF) 2012.
FICHA TECNICA LEPORSIS DE LOS CITRICOS C. DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL.CNRF,
MEXICO D.F. 27p”
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4. ANTECEDENTES
Está asociada a tres virus distintos.
Citrus Leprosis Virus tipo Citoplásmico (CiLV-C1 y CiLV-C2)
A Novel Virus of the Genus Cilevirus Causing Symptoms Similar to Citrus Leprosis
Avijit Roy, Nandlal Choudhary, Leon M. Guillermo, Jonathan Shao, Ananthakrishnan Govindarajulu, Diann Achor, G. Wei, D.
D. Picton, L. Levy, M. K. Nakhla, John S. Hartung, and R. H. Brlansky
Phytopathology 2013 103:5, 488-500
Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N)
o Transmitidos por ácaros del género Brevipalpus (Acari: Tenuipalpidae).
Sitios donde se acumulan las partículas virales en las células infectadas:
Citoplasma (C)
Núcleo (N) (Rodrigues et al., 2003).
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5. Tomado de Bastianel M.; Freitas-Astúa J.; Kitajima E.W.; Machado M. A. The citrus
leprosis pathosystem. Summa Phytopathologica, v.32, n.3, p.211-220, 2006.
•Ambos virus ocasionan lesiones locales redondas a elípticas con un punto
central de color marrón oscuro, rodeado por un halo clorótico en frutas, hojas
y ramitas.
Citoplásmico Nuclear
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6. Síntomas típicos de leprosis en plantas de naranja de Tabasco
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7. ANTECEDENTES
Considerados miembros tentativos de la familia Rhabdoviridae (Kitajima et al., 1972).
CiLV-C:
Evolutivamente relacionados con los Tobamovirus [miembro provisional de una
nueva familia de virus de plantas, (Pascon et al. 2006)].
Creación del género Cilevirus (Locali-Fabris et al., 2006).
Detección de CiLV-C por RT-PCR: genes de la proteína del movimiento (MP) y de la
replicasa (Rep).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Detección de CiLV-C en muestras de naranja empleando los primers MP. 1 y 18:
Marcador de peso molecular 50 Pb, 2: Control Negativo.
No aplicable para la
detección CiLV-N.
CiLV-C y CiLV-N
Son virus diferentes que no comparten secuencias
de nucleótidos (Freitas et al., 2005).
CiLV-C y CiLV-N
Son virus diferentes que no comparten secuencias
de nucleótidos (Freitas et al., 2005).
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8. ANTECEDENTES
CiLV-C :
Ha mostrado mayor prevalencia.
CiLV-N:
Fue detectado solo en una región de Panamá y en pocos
lugares de São Paulo y Rio Grande, en Brasil (Saavedra de
Domínguez et al., 2001; ; Chagas et al., 2006; Freitas-Astúa et al., 2004;
Kitajima et al., 2004)
JUSTIFICACIÓN E HIPOTESIS
•En México, en 2011 se observaron síntomas característicos
de leprosis en plantas de traspatio en los estados de
Querétaro y Jalisco.
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9. Lima, Toliman-Querétaro Naranja dulce,
Tabasco.
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10. JUSTIFICACIÓN E HIPOTESIS
•Los resultados negativos del análisis por RT-PCR para la detección de
CiLV-C sugirieron la presencia del tipo nuclear (CiLV-N).
•Observación de partículas virales por microscopia electrónica: Otero
Colina comunicación personal ( Memorias: Plagas cuarentenarias de los
cítricos, Jalisco 2012).
OBJETIVO
Desarrollar una metodología utilizando RT-PCR
para la detección del virus.
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Naranja dulce
Toronja
Limón Persa
Naranja agria
Mandarina
Lima
Limón mexicano
Toronja

12. MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron plantas de diferentes especies y/o variedades de cítricos (dulces y
ácidos) con síntomas característicos de leprosis colectados en cuatro localidades de
Querétaro y cinco de Jalisco
Naranja Agria Naranja Dulce
Limón PersaToronja
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13. Mandarina
Lima
Naranjo Agrio
Limón Mexicano
 Naranja Navel
MATERIALES Y METODOS
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14. MÉTODOS
•Extracción de RNA de lesiones en hoja, tallo y fruto, Kit FastPure RNA (TAK 9190)
•Síntesis de cDNa con Oligo dT (Invitrogen).
•PCR
PCR con iniciadores degenerados (LPROT1/ LPROT5 y LPROT1/LPROT3 )
Dirigidos a regiones conservadas del gen L polimerasa de Rhabdovirus .
Amplifican un fragmento de 693 y 240 nucleótidos
Condiciones de amplificación reportadas por Posthuma et al. (2002).
Amplificaciones obtenidas con los primers LPROT1-LPROT5 de muestras de
Naranja Dulce, Mandarina, Naranja Agria y Naranja Navel.
700 PB
700 PB
100 pb ND2H ND2C MaC NAH M aH NNH ND2H ND2C MaC NAH MaH NNH 1KB
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15. MÉTODOS
Secuenciación.
•Los productos de PCR se secuenciaron a través de la empresa Macrogen .
•Las secuencias obtenidas mostraron similitud el virus de la mancha de orquídea
(Orchid Fleck Virus, OFV) (GenBank)
Localized chlorosis or ringspot on leaves of different orchid types: a and b caused by orchid
fleck virus (OFV), respectively, on Miltonia sp. and Cattleya sp. c and d in Jumellea sp. and
Coelogyne sp. Tomado de Kubo et al., 2009.
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16. MÉTODOS
•Las secuencias obtenidas del fragmento de 693 nucleótidos se alinearon con el
programa Mega5 incluyendo las secuencias del Orchid Fleck Virus (OFV).
•Con la herramienta Primerquest de IDT se diseñó un par de oligos dirigidos a sitios
polimórficos de la región conservada del gen L polimerasa.
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17. MÉTODOS
•Los nuevos primers diseñados (LEPF-LEPR) amplifican un fragmento de 383 pb.
•Se evaluaron nuevamente con las diferentes muestras.
Productos de PCR obtenidos con los primers MP a partir de cDNA sintetizado con oligodT. J1 a J8 corresponden a
muestras de naranja agria (hoja, tallo) y limón mexicano procedentes de Jalisco.
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18. 100pb (-) J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 100pb
PCR con los primers OFV a partir de cDNA sintetizado con
oligodT. Muestras de naranja agria (hoja, tallo) y limón
mexicano (tallo) procedentes de Jalisco.
MÉTODOS
•Considerando que las secuencias obtenidas con los iniciadores LPROT se alinearon
con secuencias del virus de la mancha de orquídea (Orchid Fleck Virus, OFV), el cDNA
también se sometió a PCR utilizando los iniciadores reportados por Kubo et al.,
(2009).
•Este par de iniciadores amplifica un fragmento de 326 bp.
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19. RESULTADOS Y CONCLUSIONES
• A partir de secuencias obtenidas de la región conservada del gen L
Polimerasa, se diseñó un par de oligos denominados LEPF-LEPR.
• Este set de oligos mostró resultados positivos para 27 de 32
muestras procedentes de Querétaro y en las 27 muestras de Jalisco.
1 al 16 A. Muestras de procedentes de Jalisco. Lima Chichona Hoja: 1, 1A, Lima Chichona2 Hoja: 2, , Lima Chichona2
Tallo: 3, Mandarina Hoja: 4, mandarina Tallo: 5, Toronja Hoja: 6, Tallo: 7, Toronja2 Hoja: 8, Tallo: 9, Naranja Agria 1
Hoja: 10, Tallo: 11, Naranja Agria2 Hoja: 12, Tallo: 13, Naranja Agria3 Hoja: 14, Tallo: 15, Naranja Agria4 Hoja: 16,
16A. 17 y 18 muestras procedentes de Veracruz: Naranja Dulce Hoja: 17, Tallo: 18,.
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20. RESULTADOS Y CONCLUSIONES
• La leprosis de los cítricos es una enfermedad
causada por virus diferentes.
• Se ha confirmado la presencia de Citrus Leprosis
Virus-C en muestras de naranja duce procedentes
de Tabasco, Veracruz y Chiapas mediante RT-PCR
(secuencia del fragmento obtenido).
• Detección de un Rhabdovirus con alta similitud con
Orchid Fleck Virus en muestras con síntomas
característicos de leprosis en diferentes especies
de cítricos del estado de Querétaro y Jalisco.
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21. PROXIMOS PASOS…DETECTAR AL VIRUS EN
VECTOR
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22. AGRADECIMIENTOS
Ing. Juan Bautista Castillo, Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Querétaro
Tec. Edgardo Rubio Maldonado, Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Querétaro
Ing. Flavio Gutiérrez Casas , Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Jalisco
Biol. Eufrosina Cora Valencia, ENECUSAV.