El documento describe las técnicas y conceptos básicos del cultivo in vitro de tejidos y células vegetales. Estas incluyen la totipotencia de las células vegetales, la desdiferenciación y rediferenciación durante la regeneración de plantas, y el balance de reguladores del crecimiento como las auxinas y citoquininas. El cultivo in vitro permite la regeneración de plantas a partir de explantos, la micropropagación clonal y la conservación de germoplasma.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU
FACULTAD DE AGRONOMIA
M. Sc. Doris Marmolejo Gutarra
FITOMEJORAMIENTO I
CULTIVO IN VITRO EN EL
FITOMEJORAMIENTO
12/07/2022

2. 1) Totipotencia
❑ Capacidad de toda célula y explantos vegetal de regenerar
una planta entera en cultivo in vitro.
2) Desdiferenciación / Rediferenciación
❑ La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida
de las características de especialización de un tipo celular al
pasar a un tipo meristemático.
❑ El paso siguiente es la regeneración de una planta, que
corresponde a la redifereciación de las células.
3) Balance de reguladores del crecimiento
❑ Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance
entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
principalmente la AUXINAS Y CITOCININAS.
Existen tres conceptos básicos, que fundamentan el cultivo in vitro de células
y tejidos vegetales:
Totipotencia

3. TOTIPOTENCIA
❖ Capacidad de regeneración de una planta entera a partir de explantos
(tejidos vegetales), de una célula o un grupo de células en cultivos in
vitro.
In vitro
Cultivo de explantos

4. Morfogénesis in vitro
➢ La MORFOGÉNESIS, es una forma eficiente de aumentar
las posibilidades de obtener nuevos plántulas.
➢ Hay dos tipos de procesos morfogenéticos:
“Morfogénesis directa”. Los brotes recién formados emergen
directamente de tejidos de hojas, tallos y raíces, en el cultivo in
vitro.
“Morfogénesis indirecta”. Los brotes surgen de una estructura
de transición de células des diferenciadas, de un CALLO.
➢ El proceso también podría dar lugar a la embriogénesis
somática, que conduce a embriones recién formados.
Callos

5. ➢Consiste en la proliferación de brotes a
partir de yemas apicales o axilares.
➢La técnica se llama micropropagación y
es una estrategia de clonación.
➢La micropropagación se usa en la
producción comercial de plantas que se
replican GENÉTICAMENTE.; por lo
tanto, conservan exactamente la misma
base genética de la planta donante.
➢Es una herramienta industrial para la
producción en gran cantidad de plantas
de alto valor, principalmente en plantas
ornamentales y árboles frutales.
Micropropagación IN VITRO

6. CULTIVO IN VITRO
❖ Consiste en cultivar TEJIDOS VEGETALES Y CÉLULAS en medios de
cultivo.
❖ Es decir, permite regenerar plantas funcionales a partir de tejidos
embrionarios, fragmentos de tejidos, callos, células aisladas o
protoplastos.
TERMINOLOGIAS Y TECNICAS
EXPLANTO
❑Porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo in vitro.
ESTERILIZACION
❑Procedimiento para la eliminación de microorganismos.
AUTOCLAVE
Para la esterilización del tubo y/o placa petri conteniendo el medio y el explanto, bajo presión (121°C,
10 - 20 min).
REQUERIMIENTOS PARA ASEPSIA
❑Desinfección de superficie del explanto: Hipoclorito comercial diluido, evita desarrollo de
microorganismos.
❑Cámara de flujo laminar: área de trabajo, mantenida
estéril por el flujo continuo.

7. ➢ Receptáculo diseñado que permite el control de algunas
variables del ambiente físico.
➢ Generalmente se controla la temperatura, la iluminación y el
fotoperiodo; y con menos frecuencia la humedad del aire y
su composición.
Control de temperatura
➢ Se efectúa mediante un sistema de refrigeración-
calefacción, controlados a través de un termostato.
CAMARA DE CULTIVO

9. HORMONAS REGULADORAS DE CRECIMIENTO
(Producidas por las plantas)
(Aplicaciones exógenos)
➢ ACIDO ABSCÍSICO
➢ GIBERELINAS
➢ AUXINAS
➢ ETILENO
➢ CITOQUININAS
PRINCIPALES HORMONAS VEGETALES DE
CRECIMIENTO

10. 1. ACIDO ABSCÍSICO (ABA)
Funciones:
✓ Causa latencia y abscisión de yemas.
✓ Permite desarrollo y maduración de embriones somáticos, impidiendo su germinación precoz.
✓ Función de protección en plantas frente al estrés hídrico, reduce la transpiración a corto plazo y a largo
plazo induce la síntesis de proteínas aumentando la tolerancia a la desecación.
✓ La aplicación exógeno de ABA sobre hojas produce el cierre rápido de los estomas.
2. ACIDO GIBERÉLICO
➢Induce al crecimiento del tallo, en plantas con roseta y en variedades de plantas de porte bajo.
➢Promueve la elongación celular previa a la fase de división, en células jóvenes de los meristemos
subapicales.
➢Induce a la floración en variedades tardías.
➢Inhibe la floración en angiospermas leñosas y en los frutales, en coníferas inducen floración precoz.
➢Suplen los requerimientos de luz o frío que precisan muchas semillas para germinar.
➢Promueve la germinación tras la dormición producida por el ABA.

11. 3. ETILENO
✓ Coordina y regula numerosos procesos del crecimiento y de la senescencia de las plantas.
✓ Actúa coordinando las distintas respuestas fisiológicas, no solo ante situaciones adversas, sino
también ante una variedad de estímulos y procesos del desarrollo.
4. AUXINAS
✓ Promueve dominancia apical.
✓ Favorece el enraizamiento de esquejes en cultivo in vitro.
✓ Promueve extensión y elongamiento de plántulas.
✓ Promueve formación de raíces adventicias
✓ Inducen la reorientación de microfibrillas de celulosa de células que han dejado de crecer
promoviendo su elongación.
5. CITOQUININAS
✓Favorecen la embriogénesis.
✓Controlan el crecimiento de brotes y hojas.
✓Están implicadas en el control de la senescencia y en algunas especies puede producir el
reverdecimiento de hojas que están ya amarillas.

13. ➢ El medio MS, o Murashige y Skoog (1968), utilizado para la regeneración de
plantas.
➢ El medio B5 o de Gamborg et. al. (1968), o sus derivados, para el cultivo de
células y protoplastos, también en regeneración de plantas.

14. ➢El medio MS, o Murashige y Skoog (1968), utilizado para la
regeneración de plantas.
➢El medio B5 o de Gamborg et. al. (1968), o sus derivados, para el
cultivo de células y protoplastos, también en regeneración de plantas.
MEDIOS DE CULTIVO

15. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (explantos)
➢ Los EXPLANTOS provienen de tejidos vegetales, como: tallos, hojas, raíces,
pecíolos, hipocótilos, embriones o meristemos, etc.
Figura 1. Regeneración de plantas in vitro mediante el cultivo de tejidos.
A) Fuente del explanto de tejido. B) Cultivo del explanto en medio de agar.
C) Producción del callo. D) Plántula regenerada. E) plántula trasplantada en
suelo estéril.
A B C D E

16. TECNICAS DEL CULTIVO
IN VITRO
➢ Numerosas especies ornamentales
son cultivadas In vitro, para ser
vendidas como plántulas formadas en
medios artificiales de cultivo, en
frascos o tubos, para luego ser
trasplantados a macetas.
1. Reproducción comercial

19. ➢ El cultivo in vitro de meristemos, producen plantas libres
de virus en frutales, papa, hortalizas y otros cultivos.
➢ Debido a que el MERISTEMO carece de tejidos
vasculares por donde generalmente se propagan los
virus que van contaminando a la planta.
➢ Además, el meristemo apical tiene mayor velocidad de
crecimiento ganando al virus.
2. Producción de plantas libres de virus
Figura 3. Cultivo de meristemo apical.
A) Meristemo apical en el que se observa la sección que se va separar. B) Meristemo apical separado
creciendo en medio de agar. C) Plántulas regenerada a partir de meristemo apical separado. D) plántula
transferida a suelo estéril. E) Planta libre de virus creciendo en suelo natural.

20. Cultivo de meristemos
❑En la década de 1950 se inició el cultivo in
vitro de una sección muy pequeña de la
parte apical de la zona meristemática,
con pocas células, lograron una buena
tasa de multiplicación clonal y además
propágulos libres de virus.
❑Este hallazgo permitió una aplicación
importante en la producción comercial de
“plantas libres de virus” en muchos
cultivos ornamentales, alimenticios e
incluso en árboles de valor comercial.
❑La parte meristemática apical, que está
compuesta de células no diferenciadas, no
está vinculada a los sistemas vasculares y,
por lo tanto, contiene pocos o ningún virus.
Además, estas células son genéticamente
estables y responden al cultivo.

22. ✓ El material genético conservado en banco in vitro, es a
corto, mediano y largo plazo en un espacio más reducido y a
menor costo.
Limitación del crecimiento
Se debe lograr el mínimo crecimiento de las plántulas
conservadas in vitro, a través de la reducción de las sales
minerales, o el uso de inhibidores osmóticos como el manitol.
3. CONSERVACION IN VITRO DE GERMOPLASMA
➢ Las colecciones de las especies de reproducción clonal y de
semillas recalcitrantes, son conservadas en BANCOS DE
CULTIVO IN VITRO, utilizando en el medio de cultivo
retardadores del crecimiento (cicoccel y el ácido abscísico).
➢ En la conservación de germoplasma no utilizar el regulador
de crecimiento 2,4,D; ya que produce variación genética
(CALLOS).
Callos
❖ Proliferaciones de células que presentan una variación
somaclonal (variación genética) en los explantos.

24. ❖ Conservación por congelamiento a largo plazo de germoplasma
vegetativo.
❖ Conservación mediante la combinación del cultivo de meristemos
apicales con la crioconservación.
❖ Facilita el intercambio de material fitogenético libre de patógenos a nivel
internacional.
Contenedor
CRIOCONSERVACIÓN
(-196ºC en NL).
4. Cultivo de óvulos y embriones
4.1. Cultivo de óvulos
✓Procedimiento muy complejo debido a que, la manipulación del material es
difícil.
✓El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente hidratada,
que puede ser dañada con suma facilidad.
✓Es necesario realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos
sufran desecación durante el proceso.

25. 4.2. Cultivo de embriones
➢ Los embriones híbridos que resultan de cruzas entre especies diferentes,
suelen ser débiles e incapaces de sobrevivir a causa de la inadecuada nutrición
por el endospermo.
➢ Los embriones interespecíficos pueden abortar o disminuir de volumen poco
después de que se ha formado el cigoto y no llegan a formar semillas viables.
➢ Es posible salvar estos embriones inmaduros mediante el RESCATE DE
EMBRIONES y lograr que crezcan, germinen y se desarrollen en plántulas
mediante el cultivo de embriones. (Ver fig. 4).
Figura 4. Cultivo de embriones. A) Proembrión separado de tres a cinco días después
de la polinización. B) Proembrión cultivado en agar sólido. C) Desarrollo de la plántula
a partir del embrión. D) Plántula transplantada en suelo.

26. “Rescate de embriones”
➢ Consiste en aislar los embriones de una planta y cultivarlos
en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales
que les permita concluir su desarrollo normal y germinar.
➢ Rescatar los embriones abortivos derivados de la
hibridación interespecífica o intergenérica.

28. 5.1. CULTIVO DE ANTERAS
➢ Consiste en cultivar in vitro anteras que contienen
microsporas o granos de polen inmaduros en un
medio nutritivo con el propósito de obtener plántulas
haploides.
➢ Al duplicar el número cromosómico de la plántula
haploide (COLCHICINA), se obtendrá una planta
diploide totalmente homocigótica, que se conoce
como “haploide duplicado” o “doble haploide” (líneas
puras).

29. FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS HAPLOIDES MEDIANTE
CULTIVO DE ANTERAS
➢ Muchas especies, requieren cultivar anteras en el momento de la
formación de las microsporas, en la primera división
➢ En algunas especies, se cultivan pedúnculos florales que han sido
aislados en un medio nutritivo, esto aumenta la producción de
plántulas.
➢ La formulación óptima del medio nutritivo varía con la especie y en
ocasiones con los genotipos dentro de la especie.
6. Producción de variación somaclonal
➢ En la multiplicación vegetativa in vitro, se utiliza en el medio de
cultivo el regulador de crecimiento 2,4,D. Es una Auxina que induce
a la formación de callos, produciéndose así la variación somaclonal.

30. Figura 62. variación Somaclonal. A) Planta haploide a partir de la cual se obtuvo el
tejido cultivado. B) Cultivo en suspensión de células provenientes de la planta haploide.
C) Célula mutantes en el cultivo de suspensión. D) Agregado de células mutantes. E)
Planta haploide que presenta el carácter mutante.

31. Aspectos favorables de la variación somaclonal
➢ La variación somaclonal ocurre en el 15% de las plantas regeneradas.
Las mutaciones espontáneas son 1/1000 000.
➢ Las plantas somaclonales pueden estabilizarse en una generación, mientras que las mutaciones
requieren varias generaciones y retrocruzas.
➢ La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos.
CAUSAS Y MANIFESTACIONES
✓La variación somaclonal puede causar una variación temporal o una variación genética.
POTENCIAL PARA MEJORAMIENTO
✓El principal beneficio de la variación somaclonal, es la obtención de variabilidad genética.
✓Los somaclonales mutantes pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro en: resistencia a
enfermedades, herbicidas y tolerancia a estres quimicos.
✓En el futuro la variación somaclonal será muy útil para incorporar nuevos caracteres a una variedad, o
para modificar caracteres de una variedad.

32. ➢ Se obtiene mediante la fusión de dos protoplastos
pertenenientes a especies diferentes.
➢ Caso:
papa x tomate
7. Obtención de híbridos somáticos
Protoplastos
➢Son células desprovistas de la pared celular, que
adopta una forma globosa en medio líquido.
➢Son obtenidos de preferencia a partir del mesófilo de
la hoja, también a partir de suspensiones celulares.
➢Las paredes celulares son quitadas por medio de
enzimas hidrolíticas y ajustando la pared osmótica para
que la membrana plasmática no se rompa.

36. ➢ Consiste en la transferencia de ADN de una especie
donadora a otra receptora por medio de un plásmido
bacteriano, virus u otro vector, o mediante
microinyección o algún instrumento biobalística.
➢ Las plantas que reciben el nuevo ADN se dice que son
TRANSFORMADOS, y se consideran como plantas
transgénicas (GM).
➢ La selección de plantas transgénicas se realiza en
cultivo in vitro.
8. Ingeniería Genética (trangénicos)
Maíz Bt

37. La moratoria se dio en 2011, el INIA estaba desarrollando una papaya transgénica para
combatir una plaga que causa pérdidas del cultivo por encima del 60 por ciento. Los
resultados en el ambiente confinado fueron promisorios pero no se pudo avanzar a
pruebas en campo debido a la restricción legal. Actualmente el INIA no realiza ningún
tipo de investigación transgénica con cultivos agrarios o forestales, animales o
microorganismos en campo o invernaderos.
“la moratoria impide la investigación en campos experimentales para la selección de
líneas mejoradas de maíz, algodón, y alfalfa transgénicos y desincentiva la investigación
de otros productos de ingeniería genética”.
El Centro Internacional de la Papa (CIP) —organismo científico con sede mundial en
Lima— posee una de las instalaciones de bioseguridad más avanzadas de la región, pero
ante las prohibiciones legales realiza en África sus investigaciones con papas
transgénicas.
“Para Perú, una agricultura agroecológica que promueva el cuidado del agua y suelo y el
cuidado de la agrobiodiversidad es más útil y beneficiosa que algunos cultivos con
genes que benefician a algunos agricultores que pueden pagar por esa semilla. Por ese
lado está bien que continúe la moratoria ”,
02/11/20
PERÚ ANTE ENCRUCIJADA RESPECTO A LOS TRANSGÉNICOS

39. Evaluación miércoles 13 de julio, 2022
Hora. 9:40 a.m.
❑ De los siguientes temas:
- El rendimiento y sus componentes
- Mutación y poliploidía
COMUNICADO