Este documento describe un método para la detección de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC), incluyendo cepas como O157 y O104. El método implica enriquecimiento de la muestra, extracción de ácidos nucleicos, PCR en tiempo real para detectar genes asociados a STEC como stx1, stx2 y eae, y aislamiento en medios selectivos para confirmar la presencia de STEC potencialmente patógenas. El método permite detectar de forma sensible y específica diversas cepas STEC en alimentos en menos de 24

1. Detección de E. Coli STEC (O157, O104 y otros grupos productores de
toxina Shiga) en alimentos
David Tomás, jefe del laboratorio de bioensayos en ainia centro tecnológico
31 de mayo de 2011
La última crisis alimentaria ligada a una
intoxicación provocada por E. coli O104
enterohemorrágico en Alemania
(http://www.eurosurveillance.org/ViewArti
cle.aspx?ArticleId=19878) y que ha
afectado a otros países de Europa ha puesto
de manifiesto una vez más la necesidad de
disponer de métodos rápidos y eficaces
para la detección de microorganismos de
riesgo, tanto para garantizar la salud del
consumidor de forma preventiva y evitar la
alarma social como para poder identificar de forma inequivoca los alimentos implicados
en los brotes, permitiendo por una parte su retirada efectiva del mercado y por otra
evitar cierres de mercados no justificados que provocan importantes pérdidas
económicas.
Introducción
La contaminación por E. coli enterotoxigénicos ha sido habitualmente asociada a
productos cárnicos procedentes de vacuno cocinados inadecuadamente así como a leche
cruda, aunque en los últimos diez años también se han detectado casos en productos
cárnicos fermentados (salami), mayonesa y yogur. También se ha detectado un
incremento de casos relacionados con el consumo de frutas y hortalizas que han podido
ser fertilizadas con estiércol de rumiantes o contaminada durante su cosechado o
procesado. La dosis de infección de este tipo de microorganismos para producir una
toxiinfencción alimentaria, ha sido estimada en niveles muy bajos, lo que explica que
puedan producirse contagios entre personas, a través del agua e incluso durante su
manipulación en el laboratorio, por lo que este tipo de cepas de E. coli está clasificado
como un microorganismo de categoría 3 que debe ser manipulado en un laboratorio de
seguridad que cumpla con este requisito.
La intoxicación se manifiesta entre los 3 y 8 días después de consumido el alimento
contaminado, puede producir diarrea sanguinolenta y síndrome hemolítico y urémico
(HUS), gastroenteritis aguda acompañada de fiebre y ocasionalmente vómitos.
Estos microorganismos se caracterizan por la producción de potentes citotoxinas que
inhiben la síntesis de proteína en las células. Estas toxinas se conocen con el nombre de
Vero-citotoxinas o Shiga-toxinas que son las que dan nombre a las cepas de Escherichia
coli productoras de toxina Shiga (Shiga Toxin –producing Escherichia coli que se
suelen denominar por sus siglas en inglés “STEC”), que es un término sinónimo de
VTEC (Verocytotoxin producing Escherichia coli).

2. Dentro de aquellas cepas STEC se encuentran un subgrupo de serotipos que se conocen
como enterohemorrágicos o EHEC. La mayoría de enfermedades severas viene
causadas por el serogrupo O157, pero se han detectado también asociadas a O26, O111,
O103, O145 o como en el caso producido en Alemania por O104.
Límitaciones de los métodos de detección convencionales
Si bien existen numerosos métodos de referencia y alternativos para la detección de
microorganismos de origen fecal como Enterobactericeae, Coliformes o bien
Escherichia coli en alimentos, debemos tener muy en cuenta que este tipo de bacterias
STEC tienen características muy diferentes al resto de bacterias del grupo, por lo que la
gran mayoría de los métodos convencionales no permiten la detección de Escherichia
coli enterotoxigénico o STEC, como pueden ser decir E. coli O157, O104 etc…
Un claro ejemplo son las normas internacionales de referencia para la detección de
Escherichia coli en alimentos (ISO 7251:2005, ISO 16649-3:2005) que indican
explícitamente que “las cepas de Escherichia coli que no crecen a 44 °C y en particular,
aquellas que sean β-glucuronidasa negativas, tales como Escherichia coli O157 y otras
cepas patogénicas de E. coli, no serán detectadas por este método”. Ello es debido a que
estos métodos no está diseñado para tal fin, y por ello emplean determinados parámetros
como temperaturas de incubación (44ºC) así como indicadores empleados en los medios
de cultivo (ejm. actividad beta-glucuronidasa) que no son adecuados para estos STEC.
Además, y como se ha indicado anteriormente, su baja dosis infectiva unido a la posible
presencia de flora interfiriente (otras cepas de E. coli) hacen desaconsejar totalmente
estas técnicas.
En relación con la detección de STEC mediante técnicas de cultivo y otros métodos
alternativos, indicar que estos se han centrado principalmente en la detección única y
exclusivamente de E. coli O157 y no de otros STEC “no-O157”. Un ejemplo claro lo
tenemos en la Norma ISO 16654:2001, que se ha desarrollado para la detección E. coli
O157 y para ello incorpora una etapa de inmunoconcentración después de
enriquecimiento específico del serogrupo O157, para después proceder al aislamiento en
medios de agar selectivo sobre los que realizar una confirmación posterior en caso de
presencia de colonias típicas.
También otros métodos alternativos basados en el empleo de anticuerpos o análisis
moleculares se han diseñado para la detección específica de cepas de E. coli O157.
Método para la detección de E. coli STEC (incluyendo E. coli O104)
Frente a las limitaciones que se han indicado de los métodos convencionales, las
técnicas moleculares destacan por la posibilidad de diseñar un método en el que se
pueda detectar de forma sensible y específica la bacteria objeto de estudio en un plazo
corto (menos de 24 horas) con un coste ajustado. El empleo de métodos como la PCR a
Tiempo Real es el que sirve de base para muchas técnicas de detección de patógenos,
entre las que se encuentran la detección de STEC incluyendo los E. coli
enterohemorrágicos.
Por todas las limitaciones anteriormente fijadas y ante la aparición cada vez más
frecuente de cepas STEC tanto de E. coli O157 como “no-O157” surgió una iniciativa
dentro del subcomité ISO y CEN para el desarrollo de métodos analíticos

3. microbiológicos (ISOTC34/SC9; CEN 275/WG06), liderada por el Laboratorio de
Referencia de la UE para E. coli Verotoxigénicos
(http://www.iss.it/vtec/chis/index.php?lang=2&tipo=1&anno=2011) para la futura
publicación de una norma ISO que permita la detección en alimentos de E. coli
productores de toxina Shiga, asi como de las principales toxinas relacionadas y por
tanto que suponen un potencial riesgo para la salud. En este borrador de trabajo nos
basamos para realizar la puesta a punto e incorporación a nuestro laboratorio de un
método para la “Detección de E. coli O157 y otros E. coli enterotoxigénicos productores
de toxina Shiga (STEC)”
Para la ejecución del método y su implantación en laboratorios se han seguido las
directrices de diferentes normas como la ISO 17025, ISO 7218 así como Normas
específicas para análisis microbiológico molecular como la ISO 22174 entre otras.
El método analítico consiste en primer lugar en la preparación de muestra de alimentos
acorde a los protocolos habitualmente establecidos en función del tipo de matriz objeto
de análisis (según la serie de normas ISO 6887). Posteriormente se somete la muestra a
un enriquecimiento a 37ºC durante 18 horas, en el que pueden emplearse diversos
caldos:
• TSB modificado adicionado con acriflavina para productos lácteos.
• Agua de peptona tamponada para muestras que puedan contener cepas estresadas
como alimentos congelados y con poca microflora acompañante.
• TSB modificado adicionado con novobiocina, en el caso de muestras con altos niveles
de flora acompañante. Destacar en este caso que el empleo de novobiocina como agente
selectivo es controvertido puesto que a ciertas dosis este antibiótico puede ser
inhibitorio para cepas STEC “no-O157”, por lo que su concentración debe ser adaptada

4. para alcanzar un balance óptimo entre la inhibición de la posible flora acompañante
(bacterias gram positivas) y el crecimiento de todas las cepas STEC.
Después del enriquecimiento se realiza una extracción de ácidos nucleicos y
purificación de los mismos y por último la amplificación y detección simultánea de
fragmentos genéticos propios de las STEC.
Los genes seleccionados en una primera fase de cribado son los genes stx1 y stx2 que
codifican la toxina Shiga, siendo el gen stx2 el que se ha asociado más habitualmente
con enfermedades graves en humanos, así como del gen eae que codifica la intimina
relacionada con el mecanismo de adhesión de la bacteria.
En el caso del serogrupo E. coli O104:H4, se encuentra presente el gen stx2, mientras
que el resultado debe ser negativo parta los genes stx1 y eae.
(http://www.rki.de/cln_144/nn_217400/EN/Home/EHEC__O104__H4,templateId=raw,
property=publicationFile.pdf/EHEC_O104_H4.pdf)
Por lo que la presencia de al menos uno de estos genes indica la presencia presuntiva de
STEC en la muestra analizada.
En posteriores etapas y a partir de muestras positivas, se procede al aislamiento en
medios de cultivo adecuados, como el medio CT-SMAC (Agar Cefiximida telurito
sorbitol McConkey) incubado a 37ºC durante 24-48 horas, así como otros medios a
elección del laboratorio.
La presencia de colonias típicas en estos medios de cultivo en las que se confirma la
existencia de alguno de estos genes, permite concluir la presencia de STEC
potencialmente patogénicos en la muestra analizada.
Todas estas etapas analíticas incorporan controles analíticos que permiten garantizar la
fiabilidad de la técnica mediante el empleo de controles internos para detectar
inhibiciones de la señal de PCR, de cepas de referencia con resultados positivos así
como controles negativos para comprobar la ausencia de contaminaciones cruzadas en
el laboratorio.