El documento describe el modelo de Watson y Crick de la replicación semiconservativa del ADN, en el que una cadena parental se conserva y sirve como molde para la síntesis de la cadena complementaria. Explica las etapas de iniciación, elongación y finalización de la replicación, incluyendo la apertura de la doble hélice, la síntesis de cebadores de ARN, la polimerización bidireccional y la unión de los fragmentos de Okazaki. También describe la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus usos para amplificar segment

1. REPLICACIÓN DEL ADN

2. Tres modelos de replicación del ADN

3. El modelo de Watson y Crick
de la replicación del ADN
•La replicación del ADN es semiconservativa
•Una de las cadenas (parental) se conserva y
actúa como templado o molde para la síntesis
de la cadena complementaria

4. Modelo de Watson-Crick de replicación
1. Doble hélice original
2. Las cadenas se separan
3. Las bases complementarias
se alinean al templado
4. La ADN polimerasa
une los nucleótidos
alineados en una nueva
cadena contínua

5. Pruebas experimentales de la
replicación semiconservativa
1958 – Matthew Meselson y Franklin Stahl
•¿Como diferenciar a la cadena parental de la cadena hija
del ADN
•Se les ocurrió incorporar de manera controlada
isótopos pesados de 15N a la nueva cadena sintetizada

7. Transfer to 14N Invalidates
conservative
Invalidates
discontinuous
Etc.

8. El mecanismo molecular de la replicación del ADN
• Es un proceso complejo que ocurre durante la
fase S del ciclo celular
Dos etapas : iniciación y elongación
Mecanismos de síntesis de ADN en E. coli
1) Iniciación
Consiste en desenrollar a la doble hélice en el origen de
replicación y mantenerla así hasta que se posicionan las
proteínas de iniciación y el primosoma.
ADN ds
Horquilla de replicación

9. Inicio de la replicación en E. coli
La síntesis de ADN comienza en el genoma bacteriano en un sitio
específico denominado ori C y termina en un punto fijo denominado ter C.
Las bacterias tienen un solo origen de replicación
Tanto en procariotes como en eucariotes la replicación es bidireccional.
Origen de replicación
ADN de E. coli
ter C (terminacion)
El origen es rico en AT

10. Replicación de DNA: iniciación

11. Mecanismo de iniciación
•El ADN se relaja en el origen de replicación con la
ayuda de las proteínas de iniciación.
•El ADN de doble cadena se “funde”
• La helicasa también se une a las proteínas de
iniciación y utiliza energía para desenrollar al
ADN.
Helicasas:
Grupo de enzimas que usan energía para romper
los enlaces de H.
Se unen al ssDNA y se mueven en dirección 5’-3’.
origin
5’
3’ 3’
helicase 5’

12. Se requiere la síntesis de un iniciador para que
comienze la DNA polimerasa
•Las dos cadenas de DNA son antiparalelas
•La síntesis de DNA:
• Se lleva a cabo de manera continua en una cadena
• De manera discontinua en la otra cadena
La síntesis de DNA es semidiscontínua
• Con una cadena adelantada y otra retrasada
Dirección de replicación
origen
3’ Cadena contínua
5’ 5’
3’ adelantada
5’ 3’ 5’
3’ 3’
Cadena retrasada
5’ discontínua

13. La DNA polimerasa no puede inciar la síntesis
Sin un extremo 3-OH libre.
La RNA primasa crea un iniciador corto de
RNA para proporcionar una extremo 3’-OH
para para que la DNA pol III inicie la síntesis
La helicasa y la primasa forman un compejo en
la horquilla de replicación (RF=replication fork)
denominado primosoma
•La helicasa separa las dos cadenas de DNA en la
horquilla de replicación
•La primasa hace los iniciadores de RNA tanto en
la cadena adelantada como en la retrasada.
•La primasa se mueve en la dirección 5’-3’

14. primasa
Primasa: 3’
La primasa se une a la helicasa para formar al
primosoma. La primasa es activada por la helicasa 5’
La primasa no requiere un 3’-OH libre. 5’
Inicia de manera contínua en la cadena 3’ 3’
retrasada
adelantada 5’
origen retrasada Se mueve en la dirección
5’
5’-3’ sintetizando al
3’ 3’ iniciador
Iniciador de RNA
helicase 5’

15. Proteínas de unión al DNA de cadena simple
(ssDBP): Estabilizan al ssDNA, para que las
• Cadenas no se re-asocien entre cadenas
complementarias o intramolecularmente.
• Protege al DNA de la degradación
• Estímula a la DNAP III.

16. Síntesis de ADN: Elongación
• La elongación es semi-discontínua
•La síntesis de la cadena retrasada del DNA se lleva
a cabo en fragmentos de 1000-2000 bp denomi-
nados como fragmentos de Okazaki.
•Okazaki encontró fragmentos de DNA unidos a
pequeños iniciadores de RNA.

17. The Mechanism of DNA Replication: Elongation

21. Las cadenas de DNA son
antiparalelas
La síntesis de DNA ocurre de
manera contínua en la cadena
adelantada y de manera dis-
contínua en la cadena
retrasada.
•La primasa reinicia muchas veces
en la cadena retrasada.
•El primosoma se mueve en la direc-
ción 5’-3’.
•La primasa hace los iniciadores
en dirección 5’-3’.

22. Mecanismo de síntesis de ADN en E. coli
DNA Polimerasa (DNAP)
•Adiciona nucleótidos al extremo de la cadena creciente de
ADN. Requiere de un templado o molde.
•Sólo puede añadir nucleotidos en la dirección 5’ a 3’
•Requiere de un 3’-OH libre para polimerizar
•Adiciona nucleótidos complementando al templado
Hay tres tipos de DNAP (I, II y III)
Pol III es la enzima responsable de la síntesis de
las nuevas cadenas
Pol I es responsable de la remoción de los iniciadores
de RNA
Tres actividades en las DNA polimerasas
1) Actividad polimerasa 5’-3’
2) Actividad exonucleasa 3’-5’ (edición)
3) Actividad exonucleasa 5’-3’ (degradación de iniciadores)

23. Replicación 1: polimerización

24. Después que ocurre la replicación del DNA, se deben
remover los iniciadores de RNA de los fragmentos
de Okazaki y unir las piezas sueltas.
No hay RNA en la cadena final, entonces:
• se debe remover el iniciador de RNA
• reemplazar con nucleótidos de DNA
• unir los fragmentos de DNA
Los fragmentos sintetizados de DNA de la cadena
retrasada deben de ligarse

25. Función de la DNA
polimerasa I
• remover el iniciador
de RNA (exonu-
cleasa 5’-3’)
• Rellenar los huecos
con nucleótidos de
ADN (polimerasa
5’-3’)

26. DNA ligasa:
Requiere ATP para sellar las muescas y crear el enlace fosfodiester
También, durante el desenrollado del DNA, se
forman nudos adelante de la horquilla de
replicación que deben ser eliminados
RF
Overwound ahead of fork
tension

27. Topoisomerasas:
La enzima topoisomerasa II (una girasa), corta
ambas cadenas de DNA para aliviar la tensión
creada por el superenrollamiento
Ejemplo: tratar de separar los dos hilos de
un cordel y notar como se crea superenrolla-
miento y tensión adelante del sitio de apertura
y a medida que se abre más, el enrollamiento
Se incrementa y se traslada hacia adelante.
Las toposiomerasas alivian este problema.

28. Bidirectional replication of a circular chromosome
Topoisomerases:

29. Replicación 2: DNA polimerasa

31. Replicación 3

32. REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR)
Consiste en la síntesis enzimática in vitro de millones
de copias de un segmento específico de ADN

33. PCR: Polymerase Chain Reaction
(Reacción en cadena de la polimerasa)
•Es una técnica desarrollada en 1983 por
•Karen Mullis que permite sintetizar DNA in vitro
de manera enzimática.
•K. Mullis recibió el premio Nobel de química 10
años después
•Una muestra pequeña de DNa puede amplificarse
exponencialmente mediante PCR
•Es una de las técnicas más útiles y poderosas de
la Biología Molecular

35. MECÁNICA DE LA PCR
Mezcla de reacción
ADN molde, ADNpol,
dNTPs, iniciadores, buffer
PCR
gel de agarosa
ADN genómico

36. Mezcla de reacción de PCR:
ADN templado
Iniciador 1
Iniciador 2
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq polimerasa
Buffer PCR
H2O

37. Programa de PCR
temp, tiempo función
94 oC, 1 minuto desnaturalización
60 oC, 1 minuto alineamiento DNA-iniciador
72 oC, 1 minuto alargamiento del DNA
35 ciclos

38. Termociclador: Aparato de PCR para proporcionar
el programa requerido (temperatura y tiempo) para
amplificar ADN
Termociclador Hybaid
para 24 muestras
Termociclador Perkin
Elmer para 48 muestras

39. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa 1

40. UTILIDAD DE LA PCR
•Diagnóstico clínico de patógenos como virus, bacterias,
micoplasmas de animales o de plantas.
•Para detectar y diagnosticar mutaciones causantes de
enfermedades hereditarias.
•Diferenciar un organismo transgénico de uno no transgénico
•Generar huellas genéticas de animales o plantas
(analisis forense, criminalístico, paternidad, etc).
•Usos especiales en biología molecular e ingeniería genética

41. Caracterización molecular del agente causal del
mosaico amarillo de la okra en Guerrero, México.
A B C D E Yellow Mosaic on Okra leaves
M b 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 M
PM
(pb)
Marcadores
2 036
1 636 de ADN
1 018
indicativos
506, 517
396 de geminivirus
Panel A Panel B

42. Detección de
plantas
transgénicas
Amplificación por PCR de secuencias específicas del
promotor 35S y de NPTII en ADN de Arabidopsis
transformada y de A. tumefaciens C58C1(pBI121)

43. RAPDs con cuatro formas especiales
de Fusarium oxysporum
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
1, 2: f. sp. coffeae
3, 4: f. sp. ciceri
5, 6: f. sp. radicis-lycopersici
7, 8: f. sp. lycopersici
9: garbanzo
Iniciador 09 Iniciador 14