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Estudio de las B-glucosidasas del complejo celulolítico de Talaromyces amestolkiae. Aplicaciones biotecnológicas.
- 1. Estudio de lasEstudio de las ββ-glucosidasas-glucosidasas del complejo celulolítico dedel complejo celulolítico de Talaromyces amestolkiaeTalaromyces amestolkiae:: Caracterización y aplicacionesCaracterización y aplicaciones biotecnológicasbiotecnológicas ||Jesús Gil MuñozJesús Gil Muñoz ||DirectoresDirectores Mª Jesús Martínez HernándezMª Jesús Martínez Hernández Laura I. de Eugenio MartínezLaura I. de Eugenio Martínez Jorge Barriuso MaicasJorge Barriuso Maicas
- 2. Célula vegetal Celulosa Hemicelulosa LigninaRatanakhanokchai et al., 2013 | Chandel y Singh, 2011 | Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 3. Evaluación del potencial para aplicaciones industriales Purificación y caracterización de las BGL secretadas Estudio de su capacidad para producir celulasas y optimización de la producción Identificación molecular y morfológica del hongo seleccionado Screening y selección de hongos celulolíticos Expresión heteróloga y cristalización de las BGL Previamente Tesis Doctoral Futuro Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 4. Salvado de trigo Paja de trigo Salvado de avena Slurry ácido de paja de trigo Celulosa microcristalina Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Matraz 250 mL 50 mL Medio Mandels + Fuente C, 1% (p/v)
- 5. 2. Se han purificado y caracterizado tres BGLpurificado y caracterizado tres BGL. BGL-1 y BGL-2 son monómeros, mientras que BGL-3 es una proteína dímero funcionalBGL-3 es una proteína dímero funcional. BGL-2 y BGL-3 presentaron por SDS-PAGE una masa molecular similar (~100 kDa), sin embargo, la de BGL-1 fue menor (~60 kDa). El pI de las enzimas se situó entre 5,6-7,2, siendo BGL-2 la del pI más ácido, seguida de BGL-1 y BGL-3. Todas ellas son glicoproteínas, probablemente conglicoproteínas, probablemente con enlaces O-glicosídicosenlaces O-glicosídicos. Los mayores valores de actividad se encontraron a pH 4 y entre 50-60 ºC y son estables en un rango de pH 4-7 y a 50 ºC. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 6. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas
- 7. Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 8. Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor El descubrimiento del fuego propició el uso de la madera como combustible Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 9. Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor El descubrimiento del fuego propició el uso de la madera como combustible Madera para la mayoría de las actividades diarias: calefacción, cocina, cerámica, metales… Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 10. Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor El descubrimiento del fuego propició el uso de la madera como combustible Madera para la mayoría de las actividades diarias: calefacción, cocina, cerámica, metales… Con la Revolución Industrial comenzó el uso masivo de combustibles fósiles Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 11. Las emisiones de CO2 provocan el calentamiento global Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor El descubrimiento del fuego propició el uso de la madera como combustible Madera para la mayoría de las actividades diarias: calefacción, cocina, cerámica, metales… Con la Revolución Industrial comenzó el uso masivo de combustibles fósiles
- 12. Biomasa vegetal para la producción de biocombustibles Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Las emisiones de CO2 provocan el calentamiento global Energía a través de alimentos y el Sol como fuente de calor El descubrimiento del fuego propició el uso de la madera como combustible Madera para la mayoría de las actividades diarias: calefacción, cocina, cerámica, metales… Con la Revolución Industrial comenzó el uso masivo de combustibles fósiles
- 13. 2G Cultivos energéticos Paja de trigo 1G Caña de azúcar Grano de maíz Biomasa lignocelulósica Sacarosa Almidón Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 14. Célula vegetal Celulosa Hemicelulosa LigninaRatanakhanokchai et al., 2013 | Chandel y Singh, 2011 | Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Tabla 1.1. Porcentaje en peso seco de la composición de la pared celular de diferentes fuentes lignocelulósicas (Chandel y Singh, 2011). Fuente lignocelulósica Celulosa Hemicelulosas Lignina Maderas duras Abedul 40,0 23,0 21,0 Sauce 37,0 23,0 21,0 Álamo 51,0 29,0 16,0 Maderas blandas Picea 43,0 26,0 29,0 Pino 46,4 8,8 29,4 Residuos agrícolas Paja de trigo 38,2 21,2 23,4 Rastrojo de maíz 37,5 22,4 17,6 Cultivos energéticos Miscanthus giganteus 40,0 18,0 25,0 Panicum virgatum 31,0 20,4 17,6 Tabla 1.1. Porcentaje en peso seco de la composición de la pared celular de diferentes fuentes lignocelulósicas (Chandel y Singh, 2011). Fuente lignocelulósica Celulosa Hemicelulosas Lignina Maderas duras Abedul 40,0 23,0 21,0 Sauce 37,0 23,0 21,0 Álamo 51,0 29,0 16,0 Maderas blandas Picea 43,0 26,0 29,0 Pino 46,4 8,8 29,4 Residuos agrícolas Paja de trigo 38,2 21,2 23,4 Rastrojo de maíz 37,5 22,4 17,6 Cultivos energéticos Miscanthus giganteus 40,0 18,0 25,0 Panicum virgatum 31,0 20,4 17,6 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 15. Hemicelulosa Celulosa Pretratamiento Hidrólisis enzimática Fermentación Azúcares 5-6C Celulasas y hemicelulasas Lignina Lignina Levaduras Biomasa lignocelulósica Bioetanol 2GBioetanol 2G | Dashtban et al., 2009 Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Conversión a bioetanol Familias GHs | Henrissat, 1991 | Lombard et al., 2014 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 16. Compuesto orgánico más abundante en la Tierra Homopolisacárido lineal de glucosa Enlaces glucosídicos β-1,4 Puentes de hidrógeno intra- e intermoleculares Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Celulosa | Xi et al., 2013 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Región cristalina Región amorfa Región amorfa
- 17. Introducción ácido base ácido base Glicosil-enzimabase 9-10 Å 5-6 Å Davies y Henrissat, 1995 | Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Mecanismo de inversión Mecanismo de retención Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Residuos catalíticos: Asp (D) y/o Glu (E) Residuos catalíticos: Asp (D) y/o Glu (E)
- 18. Celobiosa Celotriosa Glucosa CELOBIOHIDROLASA (CBH) ENDOGLUCANASA (EG) β-GLUCOSIDASA (BGL) Introducción Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión pNPG A410
- 19. Glu-OR + BGL [Glu - BGL ] Glu-OH + BGL H2O Hidrólisis ↑ ROH Glu-OR´ + BGL R´OH Síntesis: Transglicosilación Alquilglicósidos Celooligosacáridos Introducción Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Reacciones de las BGL Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 20. • Trichoderma T. reesei, T. longibrachiatum, T. harzianum… Bajos niveles de BGL Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas • Penicillium P. purpurogenum, P. funiculosum, P. echinulatum… Altos niveles de BGL Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión RUT-C30 RUT-C30
- 21. Muestras de cereal, suelo y material vegetal en descomposición 80 hongos celulolíticos 4 hongos alta producción celulasas Placas agar-PASC | Jurado et al., 2007 Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 22. 80 hongos celulolíticos 4 hongos alta producción celulasas Muestras de cereal, suelo y material vegetal en descomposición | Jurado et al., 2007 Placas agar-PASC Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 23. Evaluación del potencial para aplicaciones industriales Purificación y caracterización de las BGL secretadas Estudio de su capacidad para producir celulasas y optimización de la producción Identificación molecular y morfológica del hongo seleccionado Screening y selección de hongos celulolíticos Expresión heteróloga y cristalización de las BGL Previamente Tesis Doctoral Futuro Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 24. ¿Cepa IJFM A795? 100 % homología: -Penicillium rubrum CBS 263.93 -Penicillium purpurogenum var. rubrisclerotium CBS 274.95 Análisis molecular RPB1 | Bt2 ITS: Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Internal Transcribed Spacer Internal Transcribed Spacer Subunidad mayor de la ARNpol II Subunidad mayor de la ARNpol II β-tubulina 2 β-tubulina 2
- 25. Análisis morfológico macroscópico IJFM A795 CBS 263.93 CBS 274.95 CYA MEA YES Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma 7 días 26-28ºC, oscuridad Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Muestras de cereal Lavado broncoalveolar Escultura de piedra Talaromyces sp.
- 26. IJFM A795 CBS 263.93 CBS 274.95 Conidióforos Conidios Estípite Rama Métula Fiálide Conidios Penicillium > Biverticillium Análisis morfológico microscópico Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma SSF, paja de trigo 7 días, 28ºC + SEM Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 27. Samson et al., 2011 | | Yilmaz et al., 2012 Penicillium > Biverticillium => Talaromyces Delimitación género Talaromyces Penicillium rubrum CBS 263.93 Talaromyces amestolkiae CBS 263.93 *** Penicillium purpurogenum var. rubrisclerotium CBS 274.95 Talaromyces amestolkiae CBS 274.95 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 28. Clado 2B Clado 2A Clado 1 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma IJFM A795 Talaromyces amestolkiae IJFM A795 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Regiones ITS Regiones ITS Primera vez que se describe como celulolítico. Primera vez que se describe como celulolítico.
- 29. Evaluación del potencial para aplicaciones industriales Purificación y caracterización de las BGL secretadas Estudio de su capacidad para producir celulasas y optimización de la producción Identificación molecular y morfológica del hongo seleccionado Screening y selección de hongos celulolíticos Expresión heteróloga y cristalización de las BGL Previamente Tesis Doctoral Futuro Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 30. T. amestolkiae IJFM A795 Matraz 250 mL 50 mL Medio Mandels + Avicel, 1% (p/v) T. amestolkiae CBS 263.93 T. amestolkiae CBS 274.95 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma BGL: 1,9 U/mL 7 días BGL: 1,9 U/mL 7 días
- 31. Salvado de trigo Paja de trigo Salvado de avena Slurry ácido de paja de trigo Celulosa microcristalina Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión BGL: 1,9 U/mL 7 días BGL: 1,9 U/mL 7 días Matraz 250 mL 50 mL Medio Mandels + Fuente C, 1% (p/v)
- 32. Matraz 250 mL 50 mL de medio Medio Mandels + Avicel, 1% (p/v) Matraz 1 L 100 mL de medio Fermentador 1,5 L 1,3 L de medio Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión BGL: 1,9 U/mL 7 días BGL: 1,9 U/mL 7 días BGL: 2,1 U/mL 5 días BGL: 2,1 U/mL 5 días BGL: 3,8 U/mL 4 días BGL: 3,8 U/mL 4 días ·12 cepas de Penicillium BGL: 0,97 – 2,45 U/mL ·T. reesei RUT-C30 BGL: 0,3 U/mL | Krogh et al., 2004 ·12 cepas de Penicillium BGL: 0,97 – 2,45 U/mL ·T. reesei RUT-C30 BGL: 0,3 U/mL | Krogh et al., 2004 ·P. verruculosum | Solov’eva et al., 2005 ·P. verruculosum | Solov’eva et al., 2005
- 33. Evaluación del potencial para aplicaciones industriales Purificación y caracterización de las BGL secretadas Estudio de su capacidad para producir celulasas y optimización de la producción Identificación molecular y morfológica del hongo seleccionado Screening y selección de hongos celulolíticos Expresión heteróloga y cristalización de las BGL Previamente Tesis Doctoral Futuro Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 34. Intercambio aniónico HiTrap Capto Adhere Intercambio aniónico Resource Q Intercambio aniónico Mono Q Exclusión molecular Superdex 75 Pico 1 Pico 2 Pico 2.1 75 kDa 1 2 3 250 150 100 50 37 25 20 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma BGL-1 BGL-2 BGL-3 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 35. Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 BGL-2 BGL-3 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 36. 97195.6 80000 100000 12 106968.5 106619.4 106202.3 105958.9 107745.6 108029.6 108307.9 105595.3 100 150 200 250 Intens.[a.u.] 102000 104000 106000 108000 110000 112000 m /z Espectrometría de masas MALDI-TOF Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 BGL-2 97,2 BGL-3 107,0 62618.5 20 40 60 80 10 0 12 0 Intens.[a.u.] 45 000 500 00 55 000 6 000 0 650 00 700 00 750 00 80 000 m /z BGL-1: 62.618 Da BGL-2: 97.196 Da BGL-3: 106.968 Da Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 37. Exclusión molecular Superose 12 Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 Monómero BGL-2 97,2 Monómero BGL-3 107,0 Dímero Mw (kDa) BGL-1 66,9 BGL-2 83,0 BGL-3 221,8 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 38. Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 Monómero √ BGL-2 97,2 Monómero √ BGL-3 107,0 Dímero √ 75 kDa 150 50 37 25 20 15 250 100 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma SDS-PAGE + Tinción PAS enlace O-glicosídico Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 39. Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 Monómero √ 6,5 BGL-2 97,2 Monómero √ 5,6 BGL-3 107,0 Dímero √ 7,2 pH 8,44 7,82 6,60 5,49 4,38 3,27 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma IEF + 4-MUG 2 mM, 1 min Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 40. Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 Monómero √ 6,5 4,0 BGL-2 97,2 Monómero √ 5,6 4,0 BGL-3 107,0 Dímero √ 7,2 4,0 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Citrato sódico, pH 3-6 Fosfato sódico, pH 6-8 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 41. Mw (kDa) Estructura cuaternaria Glico- proteína pI pH ópt Tª ópt (ºC) BGL-1 62,6 Monómero √ 6,5 4,0 50 BGL-2 97,2 Monómero √ 5,6 4,0 60 BGL-3 107,0 Dímero √ 7,2 4,0 60 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 42. BGL-1 BGL-2 BGL-3 GlucotoleranciaTermoestabilidad Ki=3,12 mM Ki=0,09 mM Ki=0,18 mM Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión BGL-1, la más glucotolerante. BGL-1, la más glucotolerante.
- 43. pNPG Celobiosa BGL-2 > BGL-3 > BGL-1 Tabla 3.6. Parámetros cinéticos de las BGL de T. amestolkiae. Km (mM) Vmax (U/mg) kcat (s-1 ) kcat/Km (s-1 mM-1 ) pNPG BGL-1 1,57 ± 0,07 86,9 ± 5,5 90,7 57,8 BGL-2 0,09 ± 0,01 17,4 ± 2,1 28,2 313,3 BGL-3 0,29 ± 0,03 62,1 ± 3,8 221,5 763,8 Celobiosa BGL-1 2,24 ± 0,20 125,0 ± 4,9 130,4 58,2 BGL-2 0,73 ± 0,03 43,1 ± 1,7 69,8 95,6 BGL-3 1,48 ± 0,06 81,9 ± 2,9 292,1 197,4 Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Aplicable en los pasos finales de la hidrólisis de la celulosa. | Bhatia et al., 2005 | Parry et al., 2001 Aplicable en los pasos finales de la hidrólisis de la celulosa. | Bhatia et al., 2005 | Parry et al., 2001 La presencia del pNP facilita la ruptura del enlace. La presencia del pNP facilita la ruptura del enlace. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión P. verruculosum: 4,6 s-1 mM-1 | Chun et al., 1991 JMB19063: 190 s-1 mM-1 | McAndrew et al., 2013 Stachybotris sp.: 818 s-1 mM-1 | Amaouri et al., 2006 P. verruculosum: 4,6 s-1 mM-1 | Chun et al., 1991 JMB19063: 190 s-1 mM-1 | McAndrew et al., 2013 Stachybotris sp.: 818 s-1 mM-1 | Amaouri et al., 2006
- 44. Glu-OR + BGL [Glu - BGL ] Glu-OH + BGL H2O Hidrólisis ↑ ROH Glu-OR´ + BGL R´OH Síntesis: Transglicosilación Alquilglicósidos Celooligosacáridos Introducción Introducción ConclusionesObjetivos Resultados Hombre y energía Bioetanol 1G vs 2G Biomasa lignocelulósica Hidrólisis celulosa Fuente celulasas Reacciones de las BGL Reacciones regioselectivas y estereoespecíficas. Reacciones regioselectivas y estereoespecíficas.
- 45. Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma pNP-G + R-OH BGL-1, BGL-2 o BGL-3 pNP-OH + R-G MeG EtG PrG BuG R: Me R: Et R: Pr R: Bu BGL-1 BGL-2 BGL-3 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Gran potencial como surfactante. Gran potencial como surfactante. Precursor de un compuesto usado en la terapia contra el SIDA. Precursor de un compuesto usado en la terapia contra el SIDA. Geranilglucósido (T. citrinoviride): | Chandra et al., 2003 Geranilglucósido (T. citrinoviride): | Chandra et al., 2003
- 46. Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma BGL-1, BGL-2 o BGL-3 n BGL-1, BGL-2 o BGL-3 <n >nHidrólisis Transglicosilación n=10 Celodecaosa Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Prebióticos en la industria alimentaria. Prebióticos en la industria alimentaria. Cuanto mayor es el sustrato de partida, mayor es el producto de transglicosilación. Cuanto mayor es el sustrato de partida, mayor es el producto de transglicosilación.
- 47. TPFTWGK EINQHVDVR NVDGALPLTGSER SLCMQDSPLGVR HYIGNEQEHFR GVDVQLGPVAGPLGR GKGVDVQLGPVAGPLGR EAQWTATLTR LGFRSLCMQDSPLGVR DTDYNTAFPAGVNVAATWDLDLAYR QINEHVDVR NWEGFAPDPVLTGQ AISSGQVAQSR HFDQSNIQPR RDLSYWDV LSLAAGASGTATFDLTRW VVPSGAFTIYVGASSR TLHELYLWPFADAVR ILFTHFADR YYSFSISWGR DLVDQLYDSPR SQSYVYITPTYLR BGL - XP_002486552 T. stipitatus ATCC 10500 AQKDQEFDSPR BGL-1 BGL-2 BGL-3 BGL - XP_002485128 P. marneffei ATCC 18224 BGL - AGA96121 T. aculeatus MALDI-TOF/TOF NCBInr BGL - XP_002152823 P. marneffei ATCC 18224 BGL - XP_002149046 T. stipitatus ATCC 10500 BGL - ACV87737 T. purpurogenus BGL - AFU91382 T. funiculosus BGL - XP_002480480 T. stipitatus ATCC 10500 Zonas conservadas → Diseño cebadores Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 48. Mw: 62,6 kDa pI: 6,5 Mw: 97,2 kDa pI: 5,6 Mw: 107,0 kDa pI: 7,2 591 aa Mw: 66,7 kDa pI: 4,8 Residuos catalíticos E304 | E493 Familia GH1 NEP | EFG 800 aa Mw: 82,9 kDa pI: 5,1 Residuos catalíticos D232 | E444 Familia GH3 KHF | SDW 837 aa Mw: 89,7 kDa pI: 4,8 Residuos catalíticos D254 | E484 Familia GH3 KHY | TDW BGL-1 BGL-2 BGL-3 2-3 intrones 1777 pb 3 intrones 2403 pb 3 intrones 2514 pb Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión 88-92% identidad con: ·BGL | XM_002485083 T. stipitatus ATCC 10500 ·BGL | XM_002149010 P. marneffei ATCC 18224 … 62% identidad con: BGL | XP_682452 A. nidulans FGSC A4 88-92% identidad con: ·BGL | XM_002485083 T. stipitatus ATCC 10500 ·BGL | XM_002149010 P. marneffei ATCC 18224 … 62% identidad con: BGL | XP_682452 A. nidulans FGSC A4
- 49. Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma GH3 GH1 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión No existen estructuras cristalinas disponibles No existen estructuras cristalinas disponibles
- 50. Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma BGL-2 65% identidad con: •4I8D y 3ZYZ H. jecorina (= T. reesei) | Karkehabadi et al., 2014 66% identidad con: •4IIB A. aculeatus | Suzuki et al., 2013 BGL-3 FnIII C-terminal N-terminal D232 | E444 5,2 Å - retención D254 | E484 5,3 Å - retención Termoestabilidad de las enzimas. | Suzuki et al., 2013 | Pozzo et al., 2010 Termoestabilidad de las enzimas. | Suzuki et al., 2013 | Pozzo et al., 2010 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 51. BGL-2 65% identidad con: PDB: 4I8D y 3ZYZ H. jecorina (= T. reesei) | Karkehabadi et al., 2014 Dominio catalítico Conector Dominio de unión a celulosa (CBD) Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma 71% identidad con: PDB: 1CBH H. jecorina (= T. reesei) | Kraulis et al., 1989 Solo se conoce una BGL de P. chrysosporium con un CBD en su secuencia. | Lymar et al., 1995 Solo se conoce una BGL de P. chrysosporium con un CBD en su secuencia. | Lymar et al., 1995 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 52. Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión BGL-1 BGL-2 BGL-3 62,6 kDa Termoestabilidad 50ºC Más glucotolerante Transglicosilación: Alquilglicósidos y celodecaosa GH1 97,2 kDa Termoestabilidad 50-60ºC Hidrólisis celooligosacáridos Transglicosilación: Alquilglicósidos y celodecaosa GH3 101,7 kDa Termoestabilidad 50-60ºC Mayor kcat/Km Transglicosilación: Alquilglicósidos y celooctaosa GH3
- 53. Evaluación del potencial para aplicaciones industriales Purificación y caracterización de las BGL secretadas Estudio de su capacidad para producir celulasas y optimización de la producción Identificación molecular y morfológica del hongo seleccionado Screening y selección de hongos celulolíticos Expresión heteróloga y cristalización de las BGL Previamente Tesis Doctoral Futuro Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 54. Talarozyme T. amestolkiae NS 50010 A. niger Paja de trigo Slurry ácido de paja de trigo ~80 g/L glucosa Steam explosion ácida Avi: 19,7 U/mL EG: 24,1 U/mL BGL: 93,2 U/mL Avi: 16,8 U/mL EG: 25,6 U/mL BGL: 198,5 U/mL Celluclast 1.5L T. reesei Avi: 89,4 U/mL EG: 157,9 U/mL BGL: 7,6 U/mL Avi: 357,6 U/mL EG: 915,0 U/mL BGL: 10,9 U/mL Ultraflo L T. reesei / T. longibrachiatum Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 55. Talarozyme T. amestolkiae NS 50010 A. niger Paja de trigo Slurry ácido de paja de trigo ~80 g/L glucosa Steam explosion ácida Avi: 0,11 U/mL EG: 0,13 U/mL BGL: 0,5 U/mL Avi: 0,04 U/mL EG: 0,06 U/mL BGL: 0,5 U/mL Celluclast 1.5L T. reesei Avi: 5,88 U/mL EG: 10,39 U/mL BGL: 0,5 U/mL Avi: 16,40 U/mL EG: 41,97 U/mL BGL: 0,5 U/mL Ultraflo L T. reesei / T. longibrachiatum Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 56. Talarozyme T. amestolkiae NS 50010 A. niger Paja de trigo Slurry ácido de paja de trigo ~80 g/L glucosa Steam explosion ácida Avi: 0,11 U/mL EG: 0,13 U/mL BGL: 0,5 U/mL Avi: 0,04 U/mL EG: 0,06 U/mL BGL: 0,5 U/mL Celluclast 1.5L T. reesei Avi: 5,88 U/mL EG: 10,39 U/mL BGL: 0,5 U/mL Avi: 16,40 U/mL EG: 41,97 U/mL BGL: 0,5 U/mL Ultraflo L T. reesei / T. longibrachiatum Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión ·Multifect CX 10L (T. reesei) + P. funiculosum + T. harzianum 97% sacarificación de bagazo de caña de azúcar. | Maeda et al., 2011 ·Celluclast 1.5L (T. reesei) + P. funicuosum 98% sacarificación de paja de cebada. | Rosgaard et al., 2006 ·Multifect CX 10L (T. reesei) + P. funiculosum + T. harzianum 97% sacarificación de bagazo de caña de azúcar. | Maeda et al., 2011 ·Celluclast 1.5L (T. reesei) + P. funicuosum 98% sacarificación de paja de cebada. | Rosgaard et al., 2006 La actividad BGL suplementada es esencial. La actividad BGL suplementada es esencial. 40% 70% Participación de enzimas no celulolíticas. Participación de enzimas no celulolíticas.
- 57. Electroforesis 2D CBH | GH7 CBH | GH6 EG | GH74 BGL-2 BGL-3 3 pH 10 kDa 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Proteína identificada Proteína NO identificada Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma 7 días: Avicel 1% (p/v) 12 proteínas identificadas NCBInr Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Perfil similar a otros ascomicetos cultivado con sustratos celulósicos. | Guais et al., 2008 | Oda et al., 2006 | Medina et al., 2005 Perfil similar a otros ascomicetos cultivado con sustratos celulósicos. | Guais et al., 2008 | Oda et al., 2006 | Medina et al., 2005
- 58. Análisis masivo de péptidos Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma Base de datos euKaryotic Orthologous Groups Base de datos euKaryotic Orthologous Groups C) Producción y conversión de energía C) Producción y conversión de energía E) Metabolismo y transporte de aminoácidos E) Metabolismo y transporte de aminoácidos G) Metabolismo y transporte de carbohidratos G) Metabolismo y transporte de carbohidratos O) Modificaciones postraduccionales O) Modificaciones postraduccionales R) Función general R) Función general Glicosil Hidrolasas nanoLC-MS/MS · Avicel: >120 proteínas · Slurry: >600 proteínas JGI | UniProt Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 59. Análisis masivo de péptidos Identificación hongo Producción celulasas Purificación y caracterización BGL Transglicosilación Secuenciación Sacarificación Secretoma nanoLC-MS/MS · Avicel: >120 proteínas · Slurry: >600 proteínas JGI | UniProt P. echinulatum | Ribeiro et al., 2012 T. reesei | Jun et al., 2011 P. echinulatum | Ribeiro et al., 2012 T. reesei | Jun et al., 2011 Xilano Swolleninas Penicillium | Jun et al., 2011 Aspergillus | Chen et al., 2010 Trichoderma | Brotman et al., 2008 Swolleninas Penicillium | Jun et al., 2011 Aspergillus | Chen et al., 2010 Trichoderma | Brotman et al., 2008 Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión Al menos, tres BGL más. Al menos, tres BGL más. El repertorio enzimático de T. amestolkiae posee potencial a la hora de formular cócteles para una sacarificación eficiente de la biomasa lignocelulósica. El repertorio enzimático de T. amestolkiae posee potencial a la hora de formular cócteles para una sacarificación eficiente de la biomasa lignocelulósica.
- 60. 1. La especie fúngica estudiada en este trabajo se identificó en base a su morfología y al análisis de las secuencias de marcadores genéticos, tales como las regiones ITS, RPB1 y Bt2. Se trata de unauna cepa decepa de Talaromyces amestolkiaeTalaromyces amestolkiae, siendo la, siendo la primera vez que se describe como productoraprimera vez que se describe como productora de celulasasde celulasas. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 61. 2. Se han purificado y caracterizado tres BGLpurificado y caracterizado tres BGL. BGL-1 y BGL-2 son monómeros, mientras que BGL-3 es una proteína dímero funcionalBGL-3 es una proteína dímero funcional. BGL-2 y BGL-3 presentaron por SDS-PAGE una masa molecular similar (~100 kDa), sin embargo, la de BGL-1 fue menor (~60 kDa). El pI de las enzimas se situó entre 5,6-7,2, siendo BGL-2 la del pI más ácido, seguida de BGL-1 y BGL-3. Todas ellas son glicoproteínas, probablemente conglicoproteínas, probablemente con enlaces O-glicosídicosenlaces O-glicosídicos. Los mayores valores de actividad se encontraron a pH 4 y entre 50-60 ºC y son estables en un rango de pH 4-7 y a 50 ºC. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 62. 3. Los estudios cinéticos revelaron que las tres BGL de T. amestolkiae mostraron mayor afinidad por el sustrato pNPG que por celobiosa. Debido a su naturaleza dimérica, la enzima BGL-3 fue la que presentó los mayores valoresBGL-3 fue la que presentó los mayores valores de eficacia catalíticade eficacia catalítica sobre ambos sustratos, seguido de BGL-2 y BGL-1. Ninguna de ellas fue activa frente a la celulosa, sin embargo, todas pudieron hidrolizar celooligosacáridos de diferentes longitudes, sugiriendo que las treslas tres enzimas son importantes en los pasos finales deenzimas son importantes en los pasos finales de la hidrólisis del polisacárido hasta glucosala hidrólisis del polisacárido hasta glucosa. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 63. 4. Las enzimas BGL-1, BGL-2 y BGL-3 deBGL-1, BGL-2 y BGL-3 de T.T. amestolkiaeamestolkiae mostraron actividad demostraron actividad de transglicosilacióntransglicosilación, siendo capaces de transferir la molécula de glucosa desde el pNPG a los alcoholes alifáticos MeOH, EtOH, PrOH y BuOH para formar los alquilglicósidos correspondientes. Además, estas enzimas pueden unir celooligosacáridos pequeños para formar otros de mayor tamaño, siendo lasiendo la celodecaosa el de mayor grado decelodecaosa el de mayor grado de polimerización detectadopolimerización detectado. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 64. 5. Las secuencias de los genes bgl-1bgl-1,, bgl-2bgl-2 yy bgl-bgl- 33 dede T. amestolkiaeT. amestolkiae presentan una altapresentan una alta homología (> 80 %) con las de las BGL dehomología (> 80 %) con las de las BGL de especies deespecies de PenicilliumPenicillium yy TalaromycesTalaromyces muy próximas filogenéticamente. La comparación de estas secuencias permitió predecir el marco de lectura de estas proteínas, cuyo análisis reveló que BGL-1 pertenece a la familia GH1,BGL-1 pertenece a la familia GH1, mientras que BGL-2 y BGL-3 son miembros demientras que BGL-2 y BGL-3 son miembros de la familia GH3la familia GH3. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 65. 6. Se construyeron modelos estructurales de BGL-modelos estructurales de BGL- 2 y BGL-3 de2 y BGL-3 de T. amestolkiaeT. amestolkiae, en base a su identidad (~ 65%) con las BGL de H. jecorina y A. aculeatus, respectivamente, de las cuales existen estructuras cristalizadas. Las enzimas presentan los dominios descritos en otras BGL fúngicas, destacando la presencia de undestacando la presencia de un dominio de unión a celulosa en BGL-2dominio de unión a celulosa en BGL-2. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 66. 7. El crudo enzimático de T. amestolkiae, usado solo o como suplemento de otros crudos comerciales, resultó ser eficaz cuando seresultó ser eficaz cuando se aplicó en la sacarificación deaplicó en la sacarificación de slurryslurry ácido deácido de paja de trigopaja de trigo. En este estudio, junto con el análisis del secretoma del hongo, se puso de manifiesto que las BGL de T. amestolkiae, así como otras proteínas presentes en el crudo, podrían ser de interés para aplicacionespodrían ser de interés para aplicaciones biotecnológicas basadas en la degradaciónbiotecnológicas basadas en la degradación de la biomasa lignocelulósicade la biomasa lignocelulósica. Introducción ConclusionesObjetivos Resultados y Discusión
- 67. ||Gracias por su atenciónGracias por su atención