1. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
JOSÉ ROBERTO ALEGRÍA COTO
Depto. de Desarrollo Científico y
Tecnológico
ralegria@conacyt.gob.sv
San Andrés,
CENTA
Auditorio 2
Martes 10 de
Diciembre 2002.
“INTRODUCCIÓN AL USO DE MARCADORES
MOLECULARES PARA CARACTERIZACIÓN DE
BIODIVERSIDAD”
GENÓMA, GEN Y
ADN RECOMBINANTE

2. • OBJETIVO
Presentar información básica de
manera comprensible sobre la
Biología Molecular y sus aplicaciones
técnicas.
• INTRODUCCIÓN
• GENÓMA Y GEN
• ADN RECOMBINANTE
Técnicas del ADN recombinante
Modelos Vegetales
Nuevas: proteínas, plantas,
animales, alimentos, fármacos
Biotecnologías promisorias
CONTENIDO:

3. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
AVANCES HISTÓRICOS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
1941 Genes codifican las proteínas
1944 Prueba que el ADN porta la información genética
1953 Determinación de estructura del ADN
1961 Código Genético, ARN mensajero, regulación génica
1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa
1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III
1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN
1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias
1974 Demostración directa de delección génica humana
1975 Southern Blotting
1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X174
1978 Biblioteca génica humana
1979 RFPL para diagnóstico prenatal, oncogenes celulares

4. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
AVANCES HISTÓRICOS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
1979-81 genes humanos clonados y secuenciados
1982 Tabaco, laprimeraplantamodificadagenéticamente
1983 Kary Mullisconcibeel PCR / Fred Sanger y colegas
publican lasecuenciadel λ lambda
1986 Lasecuenciación del ADN esautomatizada
1987 Iniciael Proyecto del GenomaHumano
1995 Essecuenciado labacteriaHaemophillus influenzae
1996 EssecuenciadalalevaduraSaccharomyces cerevisiae
1998 Essecuenciado el nemátodo Caenorhabditis elegans
1999 Essecuenciado el cromosoma22 humano
2000 EssecuenciadalamoscadelafrutaD. melanogaster /
26 dejunio sepresenta90% borrador genoma humano
2000 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana
2001 26 deenero borrador genómadel arroz Oriza sativa

5. .
Marcadores
Ingeniería Genética
Tecnología
del ADN
Fármacos
Anti-cáncer
Diagnósticos
Cultivo de
Células
Vegetales
Transferencia
de genes en
animales
Síntesis de
Sondas de
ADN
Localización
desórdenes
genéticos
Clonación
Solución de
crimenes
Producción de
Proteínas humanas
Terapia
Génica
Bancos de
ADN, ARN
Proteínas
Mapas de
Genomas
completos
Biología
Molecular
Biología
Molecular
Cultivos
CelularesCultivos
Celulares
AnticuerposMonoclonales
AnticuerposMonoclonales
Síntesis de Nuevas
Proteínas
Nuevos
Antibióticos
Nuevas
Plantas y
Animales
Nuevos
Alimentos
Recursos humanos
químicos raros
BIOTECNOLOGÍA

6. Es el estudio del
genoma y su acción.
El genoma es la suma total del material
genético presente en un organismo
particular, incluye el ADN presente en los
cromosomas y en los organelos
subcelulares (ej., mitocondrias) y el
genoma de ARN de algunos virus.
El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador del
genoma humano en un 90%, marcó un hito
histórico para la humanidad.
Tecnología del ADN
GENÓMICA
IBM SP Supercomputadora

7. Métodos utilizados en la genómica incluyen:
•Genómica Estructural. Estudio de que secuencias de
genes están presentes dentro del ADN de un organismo.
•Genómica Funcional. El estudio de que funciones son
conferidas a un organismo por una secuencia génica dada.
•Genómica Química. Se usa para comparar dos
organismos de la misma especie (uno de los cuales tiene un
gen o genes inactivados por un químico específico o una
mutación puntual.
•Análisis de la Expresión Génica. Se usa para
determinar el producto o productos producidos (tales como
una enzima u otra proteína crítica). Cuando un determinado
gen es activado, se mide la fluorescencia de las moléculas
de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm
hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las
proteínas producidas/analizadas, que están adheridas a la
superficie de hibridización sobre un biochip).
Tecnología del ADN:
GENÓMICA

8. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
Humanos
30,000
genes
GENOMAS
Chimpancé
30,000
genes
A. thaliana
25,000
genes
Ratón
30,000
genes
C. elegans
19,000
genes
D. melanogaster
13,000
genes
95% idéntico
70%
20%
60%
De 289 genes
humanos
implicados en
enfermedades,
hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
Drosophila.
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%
El genoma de un organismo es el juego completo de ADN.
La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en
1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la
secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los
genes son secuencias específicas de bases que codifican instrucciones para hacer
proteínas. Los genes son un 2% del genoma humano.
IDENTIDAD GENÉTICA
Tecnología del
ADN

9. El 14 de diciembre de 2000, se
presentó la secuencia del genoma
completo de la primera especie vegetal
la Arabidopsis thaliana.
El 26 de enero de 2001, el borrador de la
secuencia del arroz (Orizae sativa). El
funcionamiento de los genes en el arroz se
aplicaría a cultivos principales, tales como trigo
(Triticum spp) y maíz (Zea mays) con genomas
mas grandes y más dificiles de secuenciar.
El arroz es el genoma mas simple y pequeño de
los genomas de todos los cereales, tiene 50,000
genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12
cromosomas comparado con cinco de
Arabidopsis.
ecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES

10. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
Un punto rojo significa “expresión
incrementada”, un punto amarillo “igual
expresión”, uno verde “expresión
disminuida” y uno negro “ausencia de
expresión”. Unos 70a genes han variado
su nivel de expresión luego del ataque
del patógeno. La información será usada
para comprender los mecanismos de
defensa involucrados. El análisis se
realiza mediante computadoras que
identifican los genes candidatos y
proveen toda la información disponible
sobre los mismos. El microordenamiento
ha sido impreso en vidrio cuyo tamaño
real es de 22 x 40mm. El inserto muestra
una ampliación de tres bloques del
microordenamiento conteniendo 360
genes cada uno (www.cienciahoy.org)
Microarreglo o Biochip con secuencias de 11.500 genes hibridados con
ARNm de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y después
(fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas indican
genes que se han expresado en respuesta al patógeno.
ecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES

11. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
La Compañía SYNGENTA (suiza), ha demostrado
la utilidad de la genomica al utilizar la secuencia
QTL 21 del cromosoma 1 del genoma del maíz (el
cual fomenta la producción de la planta),
encontrando un arreglo y orden de genes bastante
similar con el existente en la variedad japonica o
Nipponbare del arroz que ellos secuenciaron.
Pamela Ronald, Fitopatóloga Vegetal de la Universidad
Davis de California, usando una secuencia de la variedad de
arroz indica, secuenciada por el Instituto de Genómica de
Beijing y el Centro de Genoma de la Universidad de
Washington, identificó un gen de resistencia a las
enfermedades en arroz, cuya característica fenotípica ha
sido usada por cientos de años por los fitomejoradores sin
conocer su procedencia genética.
ecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES

12. Tecnología del ADN: GENÓMICA
FUTURA
En la 14th International Genome
Secuencing and Analysis Conferen-
ce (oct. 2002), US Genomics Inc.,
presentó un aparato que lee la doble hélice de
ADN sin cortarlo. Abre la doble hélice espiral de
ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para
leerla en un lector fijo (como una pélicula de
carrete pasa por un proyector), las moléculas se
mueven a 30 M de bases por minuto. En 40
minutos se pueden Leer 3 mil M de bases.
Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo
bajará a menos de cinco minutos, por la habilidad
de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites,
un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de
información cada pocos segundos.(Uehling, M. D, Bio-
It World Nov. 12 2002).

13. genoma
Célula
cromosomas
gene
s los genes
contienen
instrucciones
para hacer
proteínas
ADN
proteínas
las proteínas actúan
solas o en complejos
para realizar las
funciones celulares
ADN ADN
ARN
PROTEÍNAS
BASES MOLECULARES
DE LA VIDA

14. R. ALEGRÍA CONACYT 2002
ESTRUCTURA DE UN GEN
• Tradicionalmente, un gen se ha
definido como un segmento de
ADN que codifica para un
polipéptido o para una molécula
funcional de ARN.
• Recientemente, los nuevos descubrimientos han
alterado radicalmente esta visión, para adoptar una
definición más vaga. De acuerdo con ello, un gen es
una secuencia de ADN genómico o de ARN que es
esencial para especificar una determinada función.
Para llevar a cabo su función el gen no necesita ser
traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita
ser transcrito.
Molécula
de
ADN

15. R. ALEGRÍA CONACYT 2002
ESTRUCTURA DE UN GEN
•Elementos típicos:
1) región reguladora
o promotor basal (caja TATA).
o sitios de unión de proteinas
reguladoras (upstream promoter).
o Realzadores (enhancers)
o Silenciadores
2) sitio de inicio de transcripción.
3) 5'UTR.
4) codón de inicio.
5) intrones y exones alternados, con
sitios de procesamiento aceptores y
donadores
6) Codón de paro.
7) 3'UTR.
8) señal de poli-adenilación.

16. ESTRUCTURA DE UN GEN
Promotores
Exones
Sitio de inicio de
la Transcripción
Sitio de
terminación
de la Transcripción
Realzadores
< 100 Kb
Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico
La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las
ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias promotoras
genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas).
Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estímulos del entorno del organismo.
Intrones

17. La Ingeniería Genética o tecnología del
ADNr se inició en la década de los 70s.
Se refiere a un grupo de tecnologías
usadas para cambiar la composición
genética de las células y mover genes a
través de las fronteras de las especies
para producir nuevos organismos.
Se pueden aislar genes, modificarlos,
introducirlos a nuevos hospederos, y
clonarlos para obtener una ventaja
novedosa sobre el organismo natural.
INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr

18. INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DEL
ADN RECOMBINANTE (ADNr)
TÉCNICA PROPÓSITO
Enzimas de Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación
Plasmidos Clase común de vector
Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas
PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas
ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero
Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta
secuencia
Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforésis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciación de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

19. R. ALEGRÍA CONACYT 2002
• Enzimas
de restricción
• ADN polimerasas
• ARN polimerasas
• Nucleasa
• ADN ligasa
• Kinasa
• Fosfatasa
• Transcriptasa reversa
TÉCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA
LA MANIPULACIÓN DEL ADN

20. R. ALEGRÍA CONACYT 2002
1. Agrobacterium. Uso de la bacteria
Como "Ingeniero Genético". La bacteria
conteniendo el inserto, infecta las células
de la planta produciendo la recombinación genética.
2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón
artificial bombardea micropartículas con el inserto,
sobre la célula.
3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que
el ADN atraviese la membrana nuclear.
4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al
PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.
5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-
cas, que atraviesan las membranas con los insertos.
Técnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

21. R. ALEGRÍA
CONACYT 2002
6. Microinyección. Una célula
es adherida a una pipeta bajo un
microscopio y el ADN foráneo es
inyectado directamente en el
núcleo usando una micropipeta
muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles,
tales como células fertilizadas de huevo animal.
7. Liposomas. Los vectores pueden ser
encapsulados en
pequeñas vesículas
de membrana para
introducir el ADN in vivo
en la célula.
Técnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

22. En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con
puntas de 1μm de diámetro, bajo la guía de un
microscopio para inyectar ADN directamente en
cloroplastos. Dichas puntas finas no dañan la
membrana del cloroplasto, pero es requerida una
alta presión para sacar el ADN de la aguja. El
control del flujo de ADN bajo alta presión es un
problema práctico significativo, que ha sido
superado introduciendo un metal líquido en la aguja
atrás del ADN. Cuando la aguja es calentada el
metal se expande forzando al ADN a salir de
manera controlada. Los investigadores también han
usado esta misma técnica para introducir ADN en
bacterias individuales y núcleos de células
eucarióticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).
Técnicas del ADNr: SISTEMAS
DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

23. R. ALEGRÍA CONACYT 2002
Las plantas que se usan como modelos de
aprendizaje en Ingeniería Genética Vegetal
son: Arabidopsis thaliana,
Nicotiana tabacum (tabaco),
Orizae sativa (arroz) y
Solanum tuberosum (papa).
Estos modelos son útiles para “aprender haciendo”
y ayudar a resolver problemas identificados por los
agricultores nacionales, mientras se capacitan los
miembros de los Centros o Unidades de
Investigación que se quieran preparar.
Ingeniería Genética:
MODELOS VEGETALES

24. ARROZ con altos niveles de tolerancia a
diferentes condiciones ambientales de estrés.
Se insertaron dos genes fusionados de
trehalosa de E. Coli y un promotor tejido
específico dependiente del estrés. Los genes
de trehalosa permiten la producción de arroz
aún si está estresado por frio, sequía o altos
niveles de salinidad e incrementa la
producción en 20%. La composición química
de los granos no cambia.
El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar
moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras
proteínas, en organismos en condiciones de
Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS

25. • 1987 secreción de Beta-lactoglobulina
en leche de ratón.
• Producción de proteína C humana en
leche de cerdos, para desórdenes
como hemofilia.
• Hormonas de crecimiento humano
en tejido seminal de cerdo.
• Antitrombina humana III, anti-
coagulante sanguíneo secretada en
leche de cabras transgénicas.
• Cabras transgénicas para producir
BioSteel fibra hecha por el hombre
con propiedades de tela de araña.
Ingeniería Genética
NUEVOS ANIMALES

26. Salmón transgénico por
hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc.
cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de
otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un
salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la
eficiencia de conversión del alimento.
ARROZ DORADO con beta caroteno de
genes de narciso y de Erwinia uredovora,
pigmentos que se transforman en pro-
vitamina A al ser ingeridos.
ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.
ARROZ con aa esenciales.
Ingeniería Genética
NUEVOS ALIMENTOS
(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

27. PAPA con la vacuna que previene la
insulina dependencia de la diabetes
mellitus 100 veces más poderosa que
la actual vacuna. PAPA con la sub-
unidad B antigénica de la enterotoxina
del Vibrio cholerae causante del
cólera). FRIJOL de SOYA con
anticuerpos que protegen contra el
virus 2 de Herpes simplex (HSV).
TABACO con anticuerpos que
previenen la caries dental producida
Ingeniería Genética
NUEVOS FÁRMACOS

28. R. ALEGRIA CONACYT 2002
Ingeniería Genética
CLONACION
Término genérico para la
replicación en un laboratorio
de genes, células u organismos
de una entidad original, con
copias genéticas exactas del
gen, célula u organismo
original. Esta técnica ha
producido avances
sensacionales en medicinas y
vacunas. También hay
investigación en clonación de
células humanas, órganos y
otros tejidos. Esto puede
producir el reemplazo de piel,
cartilagos y hueso para
victimas de quemaduras y
accidentes, o de órganos.

29. BIOTECNOLOGÍAS
PROMISORIAS
ntre las Biotecnologías
omisorias para el desarrollo
oductivo de El Salvador están:
Tecnologías Moleculares para
diagnóstico de enfermedades infecciosas,
Bioinformática, iii) Genómica,
) Modificación Genética de Cultivos,
Tecnologías recombinantes para hacer
productos terapeúticos, vi) Bioremediación,
) Química combinatoria (COMBICHEM) ,
i) Bio-nanotecnología.
p 10 Biotechnologies for Improving Health in Developing Countries: www.utoronto.ca/jcb)

30. www.conacyt.gob.sv
¡MUCHAS
GRACIAS POR SU
ATENCION¡
Atentamente:
ROBERTO ALEGRIA
ralegria@conacyt.gob.sv