La ingeniería genética permite manipular el genoma de un ser vivo para obtener productos útiles como alimentos, bebidas y medicamentos. Algunas técnicas clave incluyen la clonación de ADN, la reacción en cadena de la polimerasa, y la secuenciación de ADN. La ingeniería genética se aplica en agricultura, ganadería, medicina y el medio ambiente.

1. El ADN y la Ingeniería genética
Miguel A. Castro R.

2. Utilización de los seres vivos para obtener productos
útiles al ser humano
La ingeniería genética puede definirse como un conjunto
de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo.
• Producción de alimentos y bebidas
• Obtención de medicamentos
• Clonación, mapas genéticos,
• Organismos transgénicos, terapia génica
Biotecnología
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3. Ingeniería genética
Biotecnología
Utilización de los seres vivos para
obtener productos útiles al ser
humano
Alimentos
Medicamentos
Bebidas
Tecnología del
ADN
recombinante
(década 70)
Si hay modificación de genes
Animales y plantas
transgénicas
No hay modificación de genes
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4. Obtención de
ADN
recombinante
Clonación de
ADN
PCR Secuenciación
de ADN
Técnicas utilizadas en Ingeniería genética
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5. Medicina
• Diagnóstico de enfermedades
• Medicina forense
• Producción de medicamentos
Agricultura
• Plantas resistentes
• “Fábricas” de medicamentos
Ganadería
• Mejora del rendimiento
• Obtención de órganos
• Obtención de medicamentos
Medio ambiente
• Biorremediación
• Biolixiviación
Aplicaciones de la ingeniería genética
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6. Genómica
• Estudio genoma
• Estructural
• Funcional
Proteómica
• Estudio de las
proteínas de un
organismo
Farmacogenética
• Fabricación de
medicamentos
personalizados
Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética
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7. Tecnología del ADN recombinante
1. Fragmentar y aislar el ADN
2. Unión a vectores.
3. Introducción en las células.
4. Clonación
5. Búsqueda del clon idóneo.
6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,
7. Secuenciación.
8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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8. Enzimas de restricción
1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma)
corta y conocida.
2. Las secuencias de corte son palindrómicas
3. El corte puede ser:
o Liso
o Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)
Posteriormente, los fragmentos de distintos
ADN cortados con la misma enzima se podrán
unir mediante otro enzima, una ADN ligasa
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9. ADN recombinante
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10. Formación de ADN complementario por hibridación
• Tenemos dos tipos distintos de ADN
• Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).
• Se devuelven las condiciones adecuadas y se
produce la renaturalización.
• Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos
tipos de ADN
• El porcentaje de hibridación está relacionado con el
parentesco evolutivo
• Estas técnicas permiten localizar enfermedades
genéticas
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11. Síntesis de ADNc usando ARNm como molde
Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo
de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en
bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de
eliminación de intrones
1. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm.
2. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los
intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP.
3. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula.
4. Se hibrida un oligoncleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de
ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de
doble cadena para comenzar a trabajar.
5. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G.
6. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando
la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).
7. Se sintetiza la doble cadena
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12. AAAAAA 3’5’
TTTTTT 5’
AAAAAA 3’5’
TTTTTT 5’3’
TTTTTT 5’3’
Transcriptasa inversa
ADNc
Degradación del ARN
Síntesis de la otra cadena de ADN
ADN polimerasa INucleasa S1
elimina el
bucle
ADN de doble cadena
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13. Miguel A. Castro R.

14. Clonación de ADN
En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de
múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en
el interior de un organismo hospedador.
Estos organismos deben cumplir las siguientes características:
1. Crecimiento rápido
2. No debe ser patógeno
3. Debe favorecer la entrada del transgén
4. Debe ser muy bien conocido
5. Debe ser fácilmente manipulable
Escherichia coliMiguel A. Castro R.

15. Vectores de clonación
• Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de
ADN que llevan insertados.
• Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
• Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del
fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN
al vector, se utiliza una enzima de
restricción, y se mezcla con
fragmentos de ADN producidos con
la misma enzima.
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16. Tipos de vectores de clonación
• Plásmidos
• Virus bacteriófagos
• Cósmidos
• YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)
• Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)
• Cromosomas artificiales humanos
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17. • Son moléculas de ADN bicatenario
circular.
• Se localizan en las bacterias.
• Tienen replicación independiente.
• Genes propios (resistencias a
antibióticos) que permiten
seleccionarlos posteriormente
• Facilidad para la manipulación.
• Puntos de corte específicos para
enzimas de restricción
Plásmidos
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18. Miguel A. Castro R.

19. • Virus que infectan bacterias
• Incorporan material genético mediante el proceso de
transducción.
• Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material
del antiguo huésped.
Bacteriófagos
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20. • Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del
genoma de un bacteriófago.
• Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS
(fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético)
• Lleva varios genes de plásmidos
• Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)
• Tiene varios sitios de restricción
• Permite transportar grandes cantidades de ADN.
Cósmidos
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21. Miguel A. Castro R.

22. Son vectores de clonación de alta capacidad.
Esto permite clonar en levaduras
(microorganismos eucariotas) secuencias
de ADN de hasta un millón de pares de
bases o más, al comportarse como un
cromosoma propio de la levadura.
Cromosoma artificial de levadura
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23. Miguel A. Castro R.

24. Clonación de los fragmentos de ADN
1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo
que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos
2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.
3. Se mezclan los fragmentos.
4. Obtención de plásmidos recombinantes.
5. Se juntan los plásmidos con bacterias.
6. Incorporación de los plásmidos por transformación
bacteriana.
7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.
8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no
son resistentes).
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25. Miguel A. Castro R.

26. • Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales
contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN
derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.
• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las
secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería
contener muestras de todo el ADN del organismo.
• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos
nucleicos.
• Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc
Almacenamiento de genes clonados
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27. Identificación de clones
Una genoteca
contiene muchos
clones
Hay que identificar
el que nos interesa
Sondas de ADN
Sondas de ADN
• Oligonucleótidos de cadena sencilla
• Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la
secuencia de aminoácidos de la proteína
• Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser
identificadas
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28. Una vez localizadas, las colonias que
contienen el gen de interés se
cultivan en grandes cantidades
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29. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un
fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden
generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y
además en muy poco tiempo.
La reacción es un proceso cíclico:
1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta
para que se desnaturalice y se separe las dos
hebras.
2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-
polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una
bacteria que vive en aguas termales, Thermus
aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas
temperaturas).
3. Las cadenas recién formadas son separadas de
nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de
copias.
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30. Miguel A. Castro R.

31. * Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la
replicación enzimática (de la polimerización de DNA).
* Elementos necesarios:
- DNA polimerasa
- Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al
extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar
- Mezcla de los 4 desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
- Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidos trifosfato
(ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada
uno de ellos)
Secuenciación del ADN
OHDesoxi nucleótido Didesoxi nucleótido
(bloqueo de la síntesis de DNA)
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32. Aplicaciones de la PCR
Amplificación de:
• ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…
• ADN obtenidos de la escena de un crimen
(medicina forense).
• ADN de células embrionarias (diagnostico
prenatal de trastornos genéticos)
• ADN de genes virales (en células infectadas
por virus difíciles de detectar, como el VIH)
Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
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33. Pasos de la secuenciación
1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN
(clonación)
2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples)
3. Mezcla de todos los componentes de la reacción
4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un
ddNTP marcado
5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*
6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.
7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.
8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.
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34. Materiales necesarios
para la secuenciación
Obtención de cadenas
de distinto tamaño
acabadas en un ddNTP*
Separación de
fragmentos por
tamaños e identificación
por color
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35. Identificación de genes codificadores de proteínas
Genes que interactúan entre sí
Comparación de genomas de distintas especies
El estudio de la genómica es el
conocimiento del genoma completo y
de las interacciones entre los genes que
lo forman.
objetivo
Genómica
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36. Genómica
Conocimiento del genoma completo
Identificación de
genes
Rastreo de secuencias de inicio
de transcripción
Comparación con genes
conocidos
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37. Genómica
Interacciones entre los genes del genoma
Genes que interactúan
entre sí
La expresión de un gen afecta a otros y
varía en función de las condiciones
La expresión del genoma se
evalúa con chips de ADN
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38. Ensayo de micromatrices de ADN
Sirve para saber si un tejido normal presenta genes
alterados que podrían provocar una enfermedad
Miguel A. Castro R.

39. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomi
cs/chip/chip.html
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/m
icroarray/
Animación secuenciación genoma humano
http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#
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40. Estudios sistemáticos de las proteínas
codificadas por el genoma de un organismo.
Conjunto de proteínas de una célula, tejido o
genoma completo
PROTEÓMICA
Proteoma
Proteómica
El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en
que son ellas las que desempeñan las actividades celulares
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41. Ingeniería genética y medicina
Obtención de
productos
farmacéuticos
Insulina
Hormona de
crecimiento
Factor VIII de
coagulación
Medicina forense
Huella
genética
Marcadores
genéticos
Diagnostico de
enfermedades
Clonación de
genes
Identificación
en el
enfermo
Identificación
en
portadores
Terapia génica
Ex vivo
In vivo
In situ
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42. Obtención de
productos
farmacéuticos
Insulina
Hormona de
crecimiento
Factor VIII de
coagulación
1. Secuencia de la proteína (insulina)
2. Síntesis de los ADN
3. Obtención de plásmidos
recombinantes con los genes para
formar las dos cadenas de la insulina.
4. Expresión en E. coli
5. Purificación y procesado químico
6. Obtención de insulina activa
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43. Medicina
forense
Huella genética
Marcadores
genéticos
1. Los seres humanos difieren en un 0.1%
del genoma.
2. Estas diferencias están localizadas en
regiones cromosómicas concretas.
3. Estas zonas se usan como marcadores
genéticos
4. Con la identificación de los marcadores
se hace la huella genética (método de
Southern blot)
5. La comparación de huellas genéticas
permite resolver casos policiales.
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44. MÉTODO DE SOUTHERN BLOT
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45. Ingeniería genética y medicina
Terapia
génica
Ex vivo
In vivo
In situ
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46. Ingeniería genética y agricultura
Obtención de plantas transgénicas
Resistencia a
herbicidas
Mejora del
producto
Plantas
farmacéuticas
Se introduce un gen de
E. coli que permite
usar mayores
concentraciones de
herbicidas sin dañar a
la planta de interés, y
eliminando malas
hierbas.
Las plantas producen
sustancias medicinales,
vacunas o anticuerpos
(planticuerpos).
Se mejora el valor
nutricional del
producto, por ejemplo
añadiendo beta-
caroteno al arroz
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47. Miguel A. Castro R.

48. Ingeniería genética y medio ambiente
Biorremediación Bioadsorción Biolixiviación
Uso de bacterias
modificadas para
degradar materia
orgánica (petróleo)
Obtención de metales
a partir de minerales
de baja ley
Fijación de metales
pesados a la superficie
de la célula para
limpieza de suelos
Miguel A. Castro R.

49. Ingeniería genética y ganadería
MEJORA DE
RAZAS
PRODUCCIÓN DE
MEDICAMENTOS
ESTUDIO DE
ENFERMEDADES
HUMANAS
Obtener razas mas
resistentes, mas
productivas, con mayor
desarrollo, resistentes
a condiciones más
difíciles
Se estudia la expresión
de genes humanos en
organismos
transgénicos
Se usan animales
transgénicos.
Se pueden obtener
sustancias de interés
como proteínas
humanas para combatir
enfermedades:
Enfisema hereditario
Factores de coagulación
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50. Miguel A. Castro R.