1. HISTOLOGÍA

2. HISTORIA Se distinguen 3 periodos: Periodo Pre microscópico. - Se extiende desde el siglo IV hasta la mitad del siglo XVII, es la prehistoria de la ciencia histológica. - El hombre primitivo concebía las enfermedades como acciones llevadas a cabo por seres invisibles, espíritus. - En la mente del hombre primitivo no hay limites entre magia, religión y ciencia, la propia iglesia católica se encargo de que el hombre no cayera en el “pecado del conocimiento”. - Un ejemplo es Andrés Vesalio (1514-1564) fundador de la Anatomía Científica, condenado a muerte por practicar la disección de cadáveres.

3. Período microscópico: A mediados del siglo XVII, el biólogo y físico inglés R.Hooke (1665) perfeccionó el microscopio, permitió observar la estructura fina de los tejidos. Se inicia el segundo período, al observar una rebanada de corcho, compuesta por diminutos compartimientos separados por paredes delgadas, denominándolas “celdas o células”. En este período el anatomista Malpighi (1671), el botánico Grez (1671) y el óptico Leenwenhoek describieron la estructura de la piel, bazo, sangre, músculos y el líquido espermático. Teoría de la estructura fibrosa y granular de los organismos.

4. Teoría de la epigénesis, defendía la neoformación de los órganos, rechazando la predeterminación. En el siglo XVIII se agudizo la lucha contra estas teorías, cuando Wolf presentó su tesis “teoría del engendramiento”, (1ro en ver los embriones en animales). A finales del siglo XVIII y principios del siglo XIX, se creo microscopios acromáticos, los cuales hicieron autenticas las observaciones microscópicas y estudio de tejidos. Bauer (1862), dio la primera imagen de núcleos de células vegetales y Purkinje descubrió el núcleo en células de tejidos animales, introduciendo el concepto de “protoplasma” (citoplasma).

5. La culminación de este periodo consiste en las investigaciones de T.Schwann que formuló: Teoría celular (1838-1839) considera que los seres vivos están constituidos por células y productos celulares. A base de la teoría se estudia la composición de distintos órganos, tejidos y su histogénesis, lo que permitió crear los rasgos principales de la anatomía microscópica y la clasificación de tejidos teniendo en cuenta su estructura microscópica. Se perfeccionan los objetivos de inmersión en agua y aceite, se inventa el micrótomo y se utilizan nuevos fijadores como formalina, ácido ósmico y crómico. En el siglo XIX fueron descritos el centro celular (centrosoma), el complejo laminoso, aparato reticular intracelular, las miofibrillas, tonofibrillas, etc. Todos estos éxitos de la célula cimentaron la Citología.

6. En 1884, el médico ruso Skvartsov propuso el método de cultivo de células de la sangre fuera del organismo, otros elaboraron este método para cultivar tejidos. Los métodos de coloración vital, introducción de cuerpos extraños en el organismo permitieron el estudio de la fisiología de estructuras histológicas. En 1900, el científico Gaidukov propuso el método de la microscopia de los objetos vivos. Al mismo tiempo se inventa el micromanipulador, con la que se realizan operaciones en células aisladas: extracción de núcleos, cortes de células, con el fin de aclarar su función e importancia vital. En el siglo XX se dan investigaciones dirigidas al estudio de la Citofisiología, en especial al papel de mitocondrias y el aparato reticular intracelular en los procesos de secreción, estudio del núcleo e importancia en la transmisión de la herencia.

7. Período de la microscopía electrónica: Caracterizado por el desarrollo de la histología y aportes a la sociedad con el desarrollo de métodos nuevos de investigaciones histológicas y de métodos microscópicos electrónicos. Con ayuda de la microscopia electrónica se profundiza en la ultraestructura de las células, tejidos y órganos. Hoy día la microscopia electrónica de exploración y el uso del método de corte por congelación, posibilitan el estudio de las estructuras submicroscopicas en tres dimensiones.

8. La investigación en biomedicina ha experimentado la clonación (la oveja Dolly) y el aislamiento de líneas de células madres a partir de embriones humanos. El conocimiento de las “células madres” ha revolucionado dicho procedimiento que ya no consiste en utilizar células adultas, sino en emplear células capaces de diferenciarse en el tipo celular que sea de acuerdo a la enfermedad y síntomas del paciente. La histología se vincula a la Computación y Cibernética, su avance influyó en el desarrollo de software específico para morfometría de imágenes.

9. HISTOTECNOLOGÍA Disciplina tecnológica que estudia los fundamentos teóricos y las secuencias de manipulaciones técnicas que debe sufrir una muestra biológica, sea animal o vegetal, para obtener un “preparado histológico” que será analizado con microscopios ópticos o electrónicos particulares. Dicho preparado debe ser representativo del tejido en estudio, ya que durante su observación deberá permitir llegar a un diagnóstico sobre el estado morfo-funcional y patológico. El concepto de disciplina tecnológica surge cuando entendemos que la Histotecnología no es una ciencia en sí por carecer de método y objeto de estudio propios, sino que se conforma de marcos teóricos que ciencias como la Química, Física, Histología, Biología, etc, permiten para sustentar su práctica concreta: el Método Histológico.

10. Acino mucoso. PAS y hematoxilina. Aplicando PAS, no sólo podemos caracterizar a la célula sino que también podemos demostrar que produce glicoconjugados neutros o débilmente ácidos (ambos PAS positivos). Acino mucoso. Hematoxilina y eosina. Con esta técnica sólo podemos inferir que son células mucosas por su forma. Pero nada podemos caracterizar de sus productos secretorios

11. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS ANAE Las esterasas son un grupo de enzimas que hidrolizan esteres de ácidos carboxílicos, localizándose fundamentalmente en los lisosomas. La técnica utilizada en este caso revela todos los tipos de actividad esterasa ya que se emplea como sustrato un ester simple, el alpha-naftil acetato, por ello se denomina esterasa no específica. Los enzimas liberan el alpha-naftol que se revela con la sal diazoicapararrosanilina con nitrito sódico. Como en la mayor parte de las técnicas histoenzimáticas, se emplean tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato, ya que el proceso de deshidratación e inclusión inactivaría los enzimas cuya presencia se quiere demostrar. RESULTADOS: los puntos con actividad esterasa aparecen de color marrón rojizo. Imagen: ganglio linfático de rata.

12. AZUL DE TOLUIDINA Colorante que tiñe estructura basófilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromático (tiñe de color azul) o metacromático (tiñe de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza química de la sustancia teñida. Como colorante ortocromático, se usa frecuentemente para teñir tejido nervioso, donde tiñe la heterocromatina y los gránulos de Nissl (acúmulos de cisternas de retículo endoplásmico rugoso de los somas neuronales). El azul de toluidina tiñe metacromáticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparán sulfato, presente por ejemplo en el cartílago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en gránulos de las células cebadas.

13. RESULTADOS: Ortocromasia: las estructuras basófilas aparecen teñidas de color azul. Imagen: Soma neuronal del asta ventral de la médula espinal de rata. RESULTADOS: Metacromasia. las estructuras metacromáticas aparecen teñidas de color violeta. Imagen: CSF de filamento primario branquial de trucha arco iris.

14. FOSFATASAS Grupo de enzimas hidrolíticos que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre un sustrato determinado, adenosinatrifosfatasa, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos y su clasificación se basa en el pH, diferenciándose dos grupos: Fosfatasas alcalinas que exhiben actividad óptima a pH elevado (8,3 – 9,4) Fosfatasas ácidas que presentan actividad óptima a pH bajo (4,7 – 5,5) Para la demostración histoquímica de ambos grupos, se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato al pH correspondiente. A continuación, el naftol liberado se demuestra con una sal de diazonio (Fast Red TR para la fosfatasa alcalina y pararrosanilina con nitrito sódico para la fosfatasa ácida). Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina. Como en la mayor parte de las técnicas histoenzimáticas, se emplean tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato, ya que el proceso de deshidratación e inclusión inactivaría los enzimas cuya presencia queremos demostrar.

15. RESULTADOS: Fosfatasa alcalina: las células con actividad fosfatasa alcalina aparecen en rojo. Imagen:pronefros de trucha arco iris. Fosfatasa ácida: las células con actividad fosfatasa ácida aparecen en rojo-anaranjado. Imagen:pronefros de pez gato.

16. INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA Las técnicas inmunohistoquímicas se basan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, que permite la identificación de una proteína (el antígeno), cuya presencia queremos demostrar, mediante su unión a un anticuerpo específico (anticuerpo primario) contra ella. En este caso se ha utilizado el método de inmunodetección indirecta en dos etapas. En un primer paso, lo cortes se incuban con el anticuerpo primario, que se une a su antígeno específico allí donde esté presente. En un segundo paso, se aplica otro anticuerpo (anticuerpo secundario) contra el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario está unido covalentemente (se dice que está marcado), en este caso, al enzima peroxidasa(un enzima que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno, altamente oxidante). Finalmente, el producto de reacción de este enzima es revelado utilizando como sustrato 3,3’diaminobencidina (DAB) que al oxidarse forma un producto marrón insoluble. RESULTADOS: los puntos o células donde se localiza el antígeno aparecen de color marrón. Imagen: ganglio linfático de rata.

17. HEMATOXILINA – EOSINA Esta técnica utiliza dos colorantes: en primer lugar los cortes se someten a la acción de la hematoxilina, colorante básico, que se une a cualquier sustancia que tenga grupos ácidos, tales como los grupos fosfato del ADN y a las proteínas nucleares que poseen carga negativa. A continuación, los cortes se someten a la acción de la eosina, colorante débilmente ácido, que colorea a las estructuras básicas. RESULTADOS: las estructuras basófilas, como los núcleos, se tiñen de color azul con la hematoxilina, mientras que la eosina tiñe de rosa más o menos intenso estructuras acidófilas, como las fibras de colágeno. Imagen: conducto de Wolff de trucha arco iris.

18. PAS (REACCIÓN DEL ÁCIDO PERYÓDICO- REACTIVO DE SCHIFF) La reacción de PAS nos revela todo tipo de carbohidratos (polisacáridos, como el glucógeno, mucopolisacáridos, glucolípidos, glucoproteínas etc.). Se basa en la reacción con el reactivo de Schiff de los grupos aldehído liberados de los grupos vic-glicol presentes en los carbohidratos tras su oxidación con ácido peryódico. El reactivo de Schiff contiene fucsina básica (o pararrosanilina), que en solución ácida y en presencia de SO2 da lugar a una forma no coloreada (ácido N-sulfónico). Este reactivo reacciona con los grupos aldehído libres formando un compuesto insoluble de color púrpura. Esta técnica se utiliza sobre cortes obtenidos de tejido incluido en parafina o de tejido congelado. RESULTADOS: carbohidratos en color púrpura. Imagen: epidermis de trucha, Salmo trutta fario.

19. PERLS Esta técnica sirve para detectar el hierro que se localiza en las células en forma de gránulos de hemosiderina que es insoluble, pero no detecta el hierro contenido en la ferritina que es hidrosoluble. La reacción de Perls se basa en la liberación de los iones férricos asociados a proteínas mediante la acción del ácido clorhídrico, a su vez, los iones férricos liberados reaccionan con el ferrocianuro potásico formando un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico o azul de Prusia. Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina. RESULTADOS: precipitados azul turquesa en los puntos donde se han liberado los iones férricos. Imagen: bazo de rata.

20. TRICRÓMICO DE GOLDNER (Masson-Goldner) Las coloraciones tricrómicas usan dos o más colorantes para teñir diferencialmente las diversas estructuras histológicas, según su basofilia / acidofilia o por su apetencia por un colorante específico. El método del tricrómico de Goldner (conocido como Masson-Goldner) usa hematoxilina de Groat, y los colorantes rojo fucsina Ponçeau (xilidinaPonçeau, o Ponçeau 2R), naranja G (en solución de ácido fosfomolíbdico) y verde luz (solución acética). Diseñado por Masson y modificado por Goldner para distinguir las células de la matriz conjuntiva. RESULTADOS: estructuras basófilas (como las cromatina) de color pardo-marrón a negro, las estructuras débilmente acidófilas de rojo a naranja y las fuertemente acidófilas (como las fibras de colágeno) de azul a verde. Imagen: glándula salival de rata.

21. INMUNOHISTOQUíMICA Son técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración. En las técnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluoresceína que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. Estas técnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijación convencional, pues los antígenos están presentes en superficies celulares o son muy lábiles a la fijación en formalina.

22. La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluoresceína, se aplica corrientemente en el diagnóstico de las enfermedades cutáneas en donde tiene indicación y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatías. En las técnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) al anticuerpo primario o indirectamente por otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.

24. Hibridación in situ La técnica de hibridaciónin situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia. Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar. Lo que se produce mediante la utilización de esta técnica es: La hibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente mediante técnicas específicas (autoradiografía o inmunohistoquímica), la transformación de la secuencia en algo visible. Esta técnica es muy útil, por ejemplo, para identificar la secuencia de nucleótidos, en determinadas enfermedades de origen genético.