El documento describe las aplicaciones e historia de la ingeniería genética, incluyendo la transferencia de ADN entre organismos usando enzimas de restricción y vectores como plásmidos y cosmides. También explica técnicas como la selección de clones recombinantes, la expresión de genes en procariotas y eucariotas usando promotores, y sistemas de purificación de proteínas como fusiones.

1. INGENIERIA GENETICA ERIKA LILIANA SANCHEZ RINCON INSTITUCION EDUCATIVA PANAMERICANO PUENTE DE BOYACA 2009

2. - Medicina: diagnóstico y caracterización de enfermedades - Agricultura: plantas transgénicas - Industria farmaceútica: producción de proteínas con fines terapeúticos - Industria alimentaria: mejoramiento de cepas, aditivos alimenticios (ej. vainillina) - Industria química: productos naturales, biopolímeros, etanol Aplicaciones:

3. Algunas Técnicas que permitieron transferir información genética de un organismo a otro - enzimas de restricción permite generar moléculas recombinantes - desarrollo de vectores - técnicas de transformación

4. Enzimas de restricción

5. Vectores de clonado: - plásmidos (10 kb) - bacteriófagos (20 kb) - cósmidos (50 kb) - YAC (200 - 800 kb) (yeast artificial chromosome)

6. Vectores de clonado: plásmidos, fagos, cósmidos Plásmidos: pBR322 y pUC 19 Pequeño tamaño Origen de replicación independiente Sitios únicos de corte con ER Número múltiple de copias Marcador seleccionable Hospedero adecuado y conveniente

7. Características generales de los plásmidos como vectores de clonado : pBR322 4361 bp Orígen de replicación Marcadores genéticos Sitios de restricción únicos

8. Cósmidos y cromosomas artificiales (BAC, YAC)

9. Cósmidos como vectores de clonado: derivados del fago  , sin regiones codificantes permite el clonado de grandes fragmentos de ADN la presencia de sitios cos permite su encapsulamiento in vitro La infección (transducción) es más eficiente que la transformación Se mantiene como plásmido en E. coli

10. Bacteriófagos: ejemplo fago lambda modificado

11. Cromosomas artificiales como vectores de clonado: YACs (yeast artificial chromosomes) muy estable (se replica como un cromosoma) permite el clonado de grandes moléculas de ADN También existen los BAC (bacterial artificial chromosome)

12. Clonación molecular http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/plasmidcloning_fla.html Animación

13. Animación: http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

14. Biblioteca genómica

15. Clonado de genes eucariotas transcriptasa reversa ARN ADNs ADNd

16. ¿Cómo seleccionamos el clon recombinante que nos interesa?

17. Selección del clon recombinante buscado La selección puede basarse en: resistencia a antibióticos características nutricionales (marcadores auxotróficos) resistencia a compuestos tóxicos La selección se realiza en medio sólido

18. Réplica en placa

19. Selección del clon de interés Por hibridación con sondas de ADN

20. Otros métodos de selección se basan en la expresión de la proteína codificada por el gen de interés: b) inmunodetección: utilización de un anticuerpo específico para la proteína de interés asociado con un anticuerpo que de una reacción colorimétrica c) Detección de una actividad enzimática característica

21. Expresión de los genes clonados En procariotas: En eucariotas es similar pero con los componentes que permiten la transcripción y traducción eucariota Promotor Sitio de unión del ribosoma Señal de terminación

22. - promotor - terminador - sitio de unión a ribosoma (en procariotas) - sitios único de corte de enzimas - marcadores genéticos - orígen de replicación - tamaño pequeño Vector de Expresión

23. Promotores Constitutivos: siempre están transcribiéndose Regulables: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T) Fuerza del promotor: determina el nivel de transcripción El nivel de expresión depende del promotor y del número de copias del vector de expresión Número de copias del vector de expresión: depende del orígen de replicación que tenga puede ir desde una copia hasta cerca de 100 (1-4: bajo número de copia; 10-100: alto número de copia)

26. Clonado y expresión de proteínas heterólogas no está limitado a procariotas como hospederos, también se han utilizado eucariotas (Ej. S. cerevisiae, P. pastoris, A. niger ) La ingeniería genética no queda restringida a la expresión de proteínas sino que también utiliza otras herramientas como: - deleción de genes - desregulación de rutas metabólicas - generación de diversidad La ingeniería genética también se aplica a plantas y animales Los principios básicos son similares

27. Mutagénesis sitio dirigida: Mutagénesis dirigida en casette: deleción, interrupción o desregulación de genes Otras técnicas utilizadas en ingeniería genética:

28. Purificación de proteínas recombinantes Proteínas de Fusión: Algunos sistemas de expresión se han desarrollado de forma que permitan un proceso de purificación simple de la proteína recombinante Fusión con proteína de unión a maltosa - columna de amilosa Fusión con glutatión transferasa - columna de glutatión Adición de una cola de His - purificación en columna de Ni

29. Hospederos para sistemas de expresión Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Picchia pastoris Baculovirus Cultivos celulares (líneas celulares de mamíferos ) Animales o plantas transgénicos Criterios de elección de un sistema de expresión Rendimiento Facilidad de purificación Necesidad de modificaciones post-traduccionales Costos Diseño experimental Preferencias de uso de codones