Este documento describe los principios básicos del diseño y construcción de iniciadores y sondas de DNA para ingeniería genética. Explica que los iniciadores son secuencias cortas de ácido nucleico que sirven como punto de inicio para la replicación del DNA. Luego detalla varios criterios importantes para el diseño de iniciadores como la longitud, contenido GC, temperatura de fusión, especificidad y evitar la formación de dímeros. También cubre el uso de iniciadores degenerados y la importancia de validar la especificidad de la secuencia del

1. INGENIERIA GENETICA:
DISEÑO Y CONSTRUCCION DE INICIADORES Y
SONDAS DE DNA
M. Sc. WILLIAN CAPA ROBLES

2. Escenarios frecuentes para el uso de los primers
o iniciadores
Secuencia de DNA conocida
- Diagnostico, genotipificación
- Tener cuidado si es DNA o cDNA
Secuencia de DNA desconocida
- Se busca secuenciar el gen en cuestión
- Regiones conservadas en genes homólogos de organismos
cercanos
- Extremos amino o carboxilo terminal de la proteína codificada es
conocida

3. Un partidor, cebador, iniciador o primer, es una cadena de ácido nucléico o de
una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la replicación
del DNA con la DNA polimerasa.
Es una secuencia corta de ácido nucléico que contiene un grupo 3'hidroxilo
libre que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa
como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra
molde.

4. Los primers se usan en la secuenciación de DNA y la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR).
La secuenciación de DNA se usa
para determinar los nucleótidos en
una cadena de DNA. Un método
de secuenciación llamado
secuenciación didesoxi, conocido
también como método de
terminación de cadenas o método
Sanger, usa un partidor como
marcador de inicio para la reacción
de cadena.

5. • Cada ciclo de PCR implica tres
saltos de temperatura:
- La desnaturalización, a 94ºC.
- La hibridación de los iniciadores
con la secuencia complementaria
(45-60°C).
- La extensión, que ocurre
óptimamente a 74ºC para la
polimerasa Taq.
• La temperatura de hibridación
puede calcularse en base a la
temperatura de fusión (melting
temperature) o Tm del híbrido.
• La temperatura de hibridación
estará, por tanto, 1-3ºC por
debajo de la Tm

6. La mayoría de los reviews en optimización PCR consideran diferentes
parámetros del PCR, aunque generalmente no discuten conceptos
básicos de diseño de iniciadores o cebadores.
La eficacia y la sensibilidad del PCR depende enormemente de la
eficiencia de los iniciadores.
La capacidad de un oligonucleótido para servir como un iniciador en
PCR es dependiente de factores tales como:
La cinética de la asociación y disociación de los dúplex templados del
iniciador o cebador en el alineamiento y extensión
La estabilidad del dúplex de los oligonucleótidos coincidentes y su
localización
La eficiencia con la cual la polimerasa puede reconocer y extender un
dúplex coincidente.

7. Los iniciadores son únicos para una secuencia blanco que va a ser
amplificada y debería cumplir ciertos criterios tales como
longitud del iniciador, % GC, temperatura de alineamiento y
desnaturalización, estabilidad del extremo 5’, especificidad del
extremo 3’, etc.
Un iniciador mal diseñado puede resultar en una reacción PCR que
no trabajaría adecuadamente. La secuencia del iniciador
determina varias cosas tales como:
 La longitud del producto
 La temperatura de desnaturalización y últimamente el
rendimiento.

8. Un iniciador mal diseñado puede resultar en un poco o
ninguna formación del producto debido a la amplificación no
especifica y/o formación de dímeros, los cuales pueden
llegar a ser competitivos como para suprimir la formación
del producto.
Las secuencias de los iniciadores usados para amplificación
PCR puede tener un mayor efecto en la especificidad y
sensibilidad de la reacción.

9. Cuando se eligen los iniciadores para amplificación PCR, se deben
tener algunos criterios:
Longitud del iniciador:
Tanto la especificidad y la temperatura y tiempo de alineación son al
menos dependientes de la longitud del iniciador, este parámetro es
critico para el éxito del PCR.
Los iniciadores de 18 -24 nucleótidos en longitud son los mejores.
Los iniciadores deberían ser al menos de 18 nucleótidos en longitud para
minimizar las posibilidades de encontrar problemas con sitios de
hibridación secundaria en el vector o inserto.
Los iniciadores con longitud de una base especifica debería ser evitado.
Es especialmente importante evitar de 4 o mas G’s o C’s en una cadena.

10. Secuencias complementarias del iniciador:
Los iniciadores necesitan ser diseñados con homología
absolutamente - no intraprimer- no mas allá de las 3 pb. Si un
iniciador tiene una región de homología así misma, puede
ocurrir un “snap back”.
Otro peligro relacionado es la homología interprimer: la
homología parcial en las regiones medias de dos iniciadores
puede interferir con la hibridación. Si la homología ocurre en el
extremo 3’ de cualquiera de los iniciadores, entonces podría
ocurrir la formación de dímeros.

12. Contenido GC, poli (A/T – G/C)
40 – 60% GC (para tener buena Tm)
Sin poli (T/A-G/C)
Poli T, poli A o Poli T/A > unión más débil:
Se puede separar el complejo primer-templado
en esa zona (brecha).
Poli G, poli C o poli G/C > unión más fuerte:
annealing no específico.

13. Temperatura de melting o fusión (Tm):
Temperatura de fusión o de melting, Tm – Es la temperatura en la
cual la mitad de las cadenas de DNA son sencillas y la otra mitad esta
como doble cadena. Tm es dependiente de la composición del DNA; Un
DNA con un alto contenido de G+C tiene un Tm mas alto debido a que
tiene más enlaces de H.
Cálculos:
Menores de 13: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
Mayores de 13: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
Wallace et al. (1979)

14. Las temperaturas de melting optimas para los iniciadores en el
rango de 52-58°C, generalmente producen los mejores resultados
que los iniciadores con temperaturas de melting mas bajas.
Los iniciadores con temperaturas de melting sobre 65°C,
deberían evitarse debido a un potencial alineamiento secundario.
Es posible hacer reacciones de secuenciación con alineamiento y
extensión a 60 °C.

15. Temperatura de alineamiento
Temperatura de alineamiento o temperatura de annealing,
Tanneal – es la temperatura en la cual los primers se alinean al
DNA templete. Es calculado de la Tm.
Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión
Tanneal = Tm_primer – 4°C

16. Contenido GC (Tm y Ta están interrelacionados):
El % GC es una característica importante del DNA y provee información
acerca de la fuerza de alineamiento. Los iniciadores deberían tener un
contenido de GC entre 45 y 60%.
Para los iniciadores con un GC de menos del 50%, podría ser necesario
extender la secuencia del iniciador mas allá de las 18 bases para
mantener la temperatura de melting por encima del limite mas bajo
recomendado de 50°C.
El contenido GC y la temperatura de melting y alineamiento son
estrictamente dependientes uno del otro.

17. Secuencia del extremo 3’:
Es bien establecido que la posición terminal 3’ en los iniciadores PCR es
esencial para el control del cebado.
Los iniciadores deberían ser “pegajosos” en sus extremos 5’ mas que en
sus extremos 3’.
Un extremo 3’ pegajoso indicado por un alto contenido GC podría alinear
potencialmente múltiples sitios del DNA templete.
Una “G” o “C” es deseable en el extremo 3’ aunque la primera parte de
esta regla debería aplicarse. La abrazadera GC reduce las falsas bandas
secundarias.

18. Extremo 3’
– Evitar secuencias complementarias en 3’
5’ 3’ 5’ 3’
Primer – dimer
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Extremo 3’.
– Evitar más de dos G y/o C en los últimos
nucleótidos.
G o C asegura la unión del primer al molde
en el extremo 3’ (unión más fuerte que
A/T) > Aumenta la eficiencia de la
reacción.
– Evitar una T en la última base del
extremo 3’.
– Evitar mismatches (desapareamientos)
en el extremo 3’.

19. Los dímeros y falsos cebados causan resultados erróneos:
Los iniciadores no deberían contener secuencia complementarias
(palindromicas) dentro de ellas. Esto es que ellas no formen horquillas.
Un iniciador podría plegarse a si mismo y
resultar en un evento de cebado
improductivo que disminuye la señal
promedio obtenida.
Las horquillas que se forman por debajo de
los 50°C generalmente no son como tal un
problema. Los iniciadores no deberían
contener secuencia de nucleótidos que
conduzcan a una molécula iniciadora a
alinearse a si misma o alinearse a otro
iniciador usado en reacciones PCR
(formación de dímeros)

20. Especificidad:
La especificidad de los iniciadores es al menos dependiente del cebador.
Es evidente que hay oligos mucho mas de 24 bases que de 15 pares de
bases.
Sin embargo, los iniciadores deberían ser elegidos dado que una única
secuencia dentro del DNA templete que es amplificado.
Un iniciador diseñado con una secuencia altamente repetitiva resultaría
en una mancha cuando amplificamos el DNA genómico. Sin embargo, el
mismo iniciador podría dar una banda simple si un único clon es
amplificado de una librería genómica.

21. Deberá haber uno y sólo un sitio diana en el DNA molde, donde el cebador
se une, lo que significa que la secuencia del cebador debe ser único en la
plantilla de DNA.
Template DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’
CAGTCAACTGCTAC TGCTAAGTTG
Primer candidate 1 5’-TGCTAAGTTG-3’
Primer candidate 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’
TGCTG AGTTG
NOT UNIQUE!
UNIQUE!
Especificidad de un primer depende de la longitud (más largo > menos
probabilidad de encontrar 2 secuencias iguales en el ADN templado).

22. Iniciadores degenerados:
– Se usan cuando quiero amplificar un gen y solo conozco su
secuencia de aminoácidos.
– Se usan secuencias que estén conservadas para una familia
de proteínas.
– Se usa secuencia con menor cantidad de codones posibles.
– Se realizan todos los primers posibles para unirlos a la
secuencia de interés.
– Se incluyen sitios de restricción para clonar posteriormente.
Los programas computacionales se han desarrollado
específicamente para el diseño de iniciadores degenerados.

23. – Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del
primer:
a - Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica.
b - Se disminuye la concentración en la mezcla de cada uno de los
primers posibles.
c - No se recomienda utilizar más de 64 primers diferentes en la
mezcla.
d - Código IUPAC/IUB:

24. Código IUPAC/IUB:
A adenina R A o G
C citosina W A o T
G guanina S C o G
T timidina en el ADN Y C o T
uracilo en el ARN K G o T
N A o C o G o T H A o C o T; no G
M A o C B C o G o T; no A
V A o C o G; no T D A o G o T; no C

25. Ejemplo de primers degenerados:
CTTCCTGAACTTGCTCTTCG
CTTCCTGAACTTGCTCTTCG
CTTCCTGAACTTGGTCTTCG
CTTCCTAAAATTGGTCTTCG
* * * * * * * * * * * * * * * * *
5’ – CTT CCT RAA MTT GST CTT CG – 3’ (primer sentido)
R: G, A
M: C, A
S: C, G

26. Ejemplo de primers degenerados:
– Índice de degeneración o degeneración general:
Producto de la degeneración en cada nucleótido del primer
– En el caso del ejemplo anterior:
Índice de degeneración: 8.
Solamente 1/8 de los primers van a hibridizar exactamente con el
templado

27. • Se pueden utilizar apareamiento de bases “wobble”
para evitar agregar demasiadas degeneraciones.
• Son apareamientos entre bases diferentes de los
tradicionales Watson – Crick
Ejemplos:
G:T
G:U

28. Apareamiento de bases “Wobble”

29. En el caso del ejemplo anterior, podemos reducir el índice de 8 a 4
agregando un nucleótido “wobble” (siempre cercanos al extremo 5’):
5’ – CTT CCT RAA MTT GST CTT CG – 3’ (primer sentido)
R: G, A
M: C, A
S: C, G
5’ – CTT CCT GAA MTT GST CTT CG – 3’
– Si tengo C o T en la hebra utilizada como templado:
En este caso elijo G en el primer, porque G puede hibridizar con C o con T
– Si tengo A o G en la hebra utilizada como templado:
Elijo T en el primer, porque T puede hibridizar con A o con G

30. Otras recomendaciones:
La concentración del iniciador en una reacción de amplificación debería
estar entre 0.1 y 0.5 μm. Si fuera posible, una búsqueda web debería
ser conducida para el vector y las secuencias de DNA insertadas a fin
de verificar que el iniciador y especialmente que las 8-10 bases de
extremo 3’ son únicos.
La Inosina debería ser incluido en la secuenciación de iniciadores. Ellos
no trabajan y dan pobres resultados en el ciclo de secuenciacion.
Las caracteristicas de los iniciadores puede ser visualmente
inspeccionados por la presencia de elementos listados y un buen numero
de programas computacionales han sido desarrollados para su uso en la
selección de iniciadores o cebadores.

31. DISEÑO DE INICIADORES - BIOINFORMATICA
Los científicos han desarrollado algoritmos y programas
computacionales para el diseño de INICIADORES

34. Marcación de SONDAS
HIBRIDACION NORTHERN BLOT

35. LA PREPARACION DE LA SONDA ES CRITICA PARA LAS TECNICAS
DE HIBRIDIZACION MOLECULAR
EN LA HIBRIDIZACION:
LA SONDA Y EL ACIDO NUCLEICO A HIBRIDIZAR DEBEN ESTAR
COMO SIMPLE CADENA
SOUTHERN BLOT: DNA-DNA
NORTHERN BLOT: RNA-DNA
Además de la cuantificación de muestras, el formato de las sondas
permiten también la detección de mutaciones mediante la monitorización
del cambio de comportamiento que ocurre en las curvas de fusión de las
sondas.

36. Una sonda es un fragmento de DNA (o raramente RNA) de
pequeño tamaño (normalmente entre 100 y 1000 bases)
usado en biología molecular como herramienta para detectar
la presencia de DNA o RNA de secuencia complementaria
parecida o igual.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana
monocatenaria (ADNc ó ARN) mediante un mecanismo de
hibridación que forma una estructura bicatenaria, una de las
hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana.

37. La detección del método depende de lo que se requiera:
a) Sensibilidad. Depende del fácil acceso que tenga la sonda marcada, la cantidad
y tipo de marca incluída en la sonda y el método de detección.
b) Resolución. La resolución de la señal puede variar de sitios específicos en una
célula, lo cual depende de la sonda marcada y del método de detección.
c) Especificidad. La especificidad de la señal depende de la selectividad del lavado
y de secuencias similares que interfieran en el pegado de la sonda.

38. Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con
quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de
rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una
emisión de luz detectable.
El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un
lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej,
biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este
caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje.
Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las
quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la
segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos
para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.

39. • Se usa un nucleotido marcado:
α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: Generalmente dCTP
biotina-11-d UTP, dioxigenina-11-d UTP
• La sonda puede ser/ o no radioactiva, en todos los casos
debe tener alta actividad especifica.
• Determinación de actividad especifica: una vez marcado
el DNA se precipita con TCA 5% y se cuenta la marca
precipitada.
• AE = total de cuentas incorporadas
masa de acido nucleico usado

40. Métodos de marcación de SONDAS
NICK TRANSLATION
• Actúan dos enzimas: dnasa 1 y dna polimerasa 1
• Se utiliza dna doble cadena
• Se introduce nick (agujero) al azar en una de las cadenas
del DNA.
• Se usa enzima con actividad 5’-3’ exonucleasa: remueve
el dNTPs del extremo 5’ (pol 1) y el nick se va
trasladando
• Se separa el marcado del resto por precipitación con
etanol o columna sephadex

42. RANDOM PRIMER
• Se utiliza una secuencia de oligonucleotidos conocida o de tipo
hexanucleotidos (cualquier secuencia consenso)
• Se usa dna simple cadena (se desnaturaliza por calor)
• Se usa enzima que no posea actividad 5’ – 3’ exonucleasa para que
no degrade al primer (fragmento exo-klenow)
• Se genera cadena complementaria
• Se separa el marcado del resto por precipitacion con etanol o
columna sephadex

44. Marcación de SONDAS
NICK TRANSLATION RANDOM PRIMER
MASA A MARCAR 50 – 500 ng 25 – 250 ng
ACTIVIDAD
ESPECIFICA
5 x 10 8 dpm/ug 1 X 10 9 dpm / ug
LARGO del
FRAGMENTO
MARCADO
200 – 500 d NTP 200 – 2000 d NTP
SONDA NO RADIOACTIVA:
SE USA 1 ug DE MASA A MARCAR
SENSIBILIDAD COMO RAD. CON AE = 1 x 10 8 dpm/ug

45. MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
• Se utilizan para realizar screening de bibliotecas
• Se marcan usando la enzima deoxinucleotido transferasa (tdt) que
agrega dNTPs al extremo 3’
• Templado de 20 a 30 pb
• Masa a marcar: 20 ng
• Actividad especifica: 5 x 10 6 dpm/ ug
• Se obtiene baja señal que ayuda a no tener fondo “sucio”

47. Tipo de sonda y método de síntesis
i) Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando técnicas
como “nick translation, random priming o PCR”, en las cuales el nucleótido marcado
es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena actividad específica.
Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para
detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la
concentración de la sonda marcada es reducida.
ii) Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas
utilizando “primer extension” en templados de cadena simple o por PCR con un
nucleótido marcado. Éste último es el más usado porque es más fácil de llevar a cabo
y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material. El PCR permite una
gran flexibilidad en la elección de las secuencias marcadas por el uso de primers.
Estas marcas han sido ampliamente usadas.

48. iiii) Oligonucleótidos (entre 20 y 40 bases). oligonucleótidos modificados
durante la síntesis química o adicionando una cola marcada. Una de las desventajas
es que algunos oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la
sensibilidad disminuye.
iv) Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de
una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es
clonada en un vector que flanqueará dos sitios distintos de iniciación.
La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en dirección opuesta al gen
endógeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el
extremo 5’ cohesivo, por que se ha reportado, que el extremo 3’ romo promueve la
síntesis de transcritos anormales.

49. Los isotopos radiactivos difieren en cuanto a la resolución de
la señal, la velocidad en obtención de resultados y la
estabilidad de la sonda.

50. Marcaje con digoxigenina (DIG)
El método de marcaje con DIG está basado en un esteroide
aislado de las plantas Digitalis purpurea y Digitalis lanata. Las
hojas y flores de estas plantas son la única fuente natural de
digoxigenina.
La digoxigenina se enlaza en la posición C5 de la uridina
mediante un brazo que contiene 11 átomos de carbono. Los
nucleótidos marcados con DIG pueden ser incorporados a
las sondas de ácidos nucleicos por DNA polimerasas (E. coli
DNA polimerasa I, T4 DNA polimerasa, T7 DNA
polimerasa, reverso transcritptasa y Taq DNA polimerasa),
al igual que RNA polimerasas (SP6, T3 O T7 RNA
polimerasa) y transferencia terminal.
Los ácidos nucleicos pueden ser marcados químicamente
con DIG-NHS ester o con DIG Chem-Link. Las sondas DIG-marcadas
pueden ser detectadas con una alta especificidad
por anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son
conjugados a fosfatasa alcalina, peroxidasa, fluoresceína,
rodamina u oro coloidal.

51. Marcaje con biotina
El marcaje de ácidos nucleicos con biotina-dUTP (Figura 4) fue
desarrollado por David Ward y colaboradores en la Universidad
de Yale (Langer et al., 1981). También se han implementado
procedimientos fotoquímicos al igual que un número de métodos
de biotinilación química han sido descritos
En principio la biotina puede ser
detectada en la misma longitud de onda
que la digoxigenina, dependiendo del
fluoróforo acoplado a estreptavidina.
La estreptavidina o avidina es más
frecuentemente usada porque éstas
moléculas tienen una alta capacidad de
enlace con la biotina

52. En (a) un isótopo radiactivo se une al
fragmento de ADN; la consecuente
emisión de radiación a o b puede
imprimir una placa sensible
(autorradiografia). En (b) y (c), a
través de biotina y estreptavidina, o
bien de la digoxigenina y un
anticuerpo que la reconoce, la enzima
fosfatasa alcalina marca la sonda
dando lugar, con su presencia, a un
cambio de color del reactivo azul de
tetrazolio (reacción coloreada). En (d)
la biotina, con la ayuda de la
estreptavidina, permite ligar una
partícula magnética que puede ser
separada, junto con la sonda,
mediante el empleo de un imán
(separación magnética); en (e) y (f), la
peroxidasa, unida al ADN en forma
directa o a través de fluoresceina y
un anticuerpo, da lugar a la emisión de
luz mediante el empleo del reactivo
luminol (reacción luminosa).

53. Ejemplo:
Sonda
Sybr
Green