La clonación molecular implica 3 pasos: 1) cortar el DNA en lugares específicos usando enzimas de restricción, 2) unir el fragmento de DNA deseado a un vector de clonación como un plásmido, 3) transferir el DNA recombinante a células huésped como E. coli para su replicación. Esto permite aislar y estudiar genes específicos.
Práctica de laboratorio realizada en el Laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas Ext. Ocozocoautla, Chiapas, de la carrera en Químico Farmacobiólogo, respecto a la materia de Biología Celular 2° semestre.
Práctica de laboratorio realizada en el Laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas Ext. Ocozocoautla, Chiapas, de la carrera en Químico Farmacobiólogo, respecto a la materia de Biología Celular 2° semestre.
CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES:
Dada la variedad de factores implicados, existen diversos planteamientos para clasificar las mutaciones. Se estudiarán bajo tres criterios: tipo de célula, magnitud de la mutación y mecanismos causantes de la mutación.
TIPO DE CÉLULA QUE SUFRE LA MUTACIÓN
Mutación en células de la línea germinal
Esta alteración se origina en alguna de las divisiones mitóticas o meióticas de la gametogénesis, a partir de células progenitoras diploides de las gónadas
Mutación en células somáticas
A diferencia de las anteriores, las mutaciones somáticas (en células no reproductoras) sólo se transmiten a las células hijas (en la mitosis), y no a un organismo completo. Estas mutaciones determinan las características normales o patológicas del individuo, pero los cambios nunca son heredables.
MUTACIONES A PEQUEÑA ESCALA O PUNTUALES
Las anomalías a gran escala ocurren por duplicaciones, pérdidas o reagrupamientos que alteran una región de millones de pares de bases y se reflejan en la estructura del cromosoma.
Las mutaciones a pequeña escala, sencillas, puntuales, mínimas o micro modificaciones implican habitualmente a un solo nucleótido (y, como consecuencia, a su complementario en la otra hebra del DNA).
Las mutaciones puntuales son tan representativas que, a veces, se asumen como el único tipo de mutación existente. Estas variaciones genéticas heredadas contribuyen a las diferencias entre individuos dentro de una población.
Efecto sobre la secuencia de la proteína sintetizada
El cambio de secuencia del DNA generado por la mutación puede tener distintos efectos sobre la secuencia de aminoácidos codificada y, en consecuencia, sobre la proteína que se sintetice y su función. Se distingue por ello entre mutaciones silenciosas y no silenciosas.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Mi nombre es Jaime Guillermo González Gámez y actualmente vivo en Guadalajara, Jalisco, México.
Soy Medico Alergólogo e Inmunólogo, e imparto la materia de inmunología en la UVM Campus Zapopan, también tengo un consultorio privado y trabajo en el Hospital Regional Valentín Gómez Farías
No saben como me llena de alegría que bastantes personas puedan aprender de mis presentaciones, cualquier pregunta de los temas no duden en marcar a mis teléfonos, estoy a sus ordenes.
Mexicaltzingo #1979 (Col. Americana) 44160 Guadalajara
01 33 3825 3063
01 33 3836 3299
www.facebook.com/jaimeguillermo.gonzalezgamez
CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES:
Dada la variedad de factores implicados, existen diversos planteamientos para clasificar las mutaciones. Se estudiarán bajo tres criterios: tipo de célula, magnitud de la mutación y mecanismos causantes de la mutación.
TIPO DE CÉLULA QUE SUFRE LA MUTACIÓN
Mutación en células de la línea germinal
Esta alteración se origina en alguna de las divisiones mitóticas o meióticas de la gametogénesis, a partir de células progenitoras diploides de las gónadas
Mutación en células somáticas
A diferencia de las anteriores, las mutaciones somáticas (en células no reproductoras) sólo se transmiten a las células hijas (en la mitosis), y no a un organismo completo. Estas mutaciones determinan las características normales o patológicas del individuo, pero los cambios nunca son heredables.
MUTACIONES A PEQUEÑA ESCALA O PUNTUALES
Las anomalías a gran escala ocurren por duplicaciones, pérdidas o reagrupamientos que alteran una región de millones de pares de bases y se reflejan en la estructura del cromosoma.
Las mutaciones a pequeña escala, sencillas, puntuales, mínimas o micro modificaciones implican habitualmente a un solo nucleótido (y, como consecuencia, a su complementario en la otra hebra del DNA).
Las mutaciones puntuales son tan representativas que, a veces, se asumen como el único tipo de mutación existente. Estas variaciones genéticas heredadas contribuyen a las diferencias entre individuos dentro de una población.
Efecto sobre la secuencia de la proteína sintetizada
El cambio de secuencia del DNA generado por la mutación puede tener distintos efectos sobre la secuencia de aminoácidos codificada y, en consecuencia, sobre la proteína que se sintetice y su función. Se distingue por ello entre mutaciones silenciosas y no silenciosas.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Mi nombre es Jaime Guillermo González Gámez y actualmente vivo en Guadalajara, Jalisco, México.
Soy Medico Alergólogo e Inmunólogo, e imparto la materia de inmunología en la UVM Campus Zapopan, también tengo un consultorio privado y trabajo en el Hospital Regional Valentín Gómez Farías
No saben como me llena de alegría que bastantes personas puedan aprender de mis presentaciones, cualquier pregunta de los temas no duden en marcar a mis teléfonos, estoy a sus ordenes.
Mexicaltzingo #1979 (Col. Americana) 44160 Guadalajara
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2. RESULTADOS DE APRENDIZAJE
Comprende y explica los elementos y
fundamentos de la clonación molecular.
Explica los procedimientos básicos
para la clonación molecular.
Conocer y discutir aplicaciones de la
clonación molecular en diferentes
campos y actividades humanas.
3. ERRORES FRECUENTES
Confundir la acción de las enzimas
que participan en la clonación.
No comprender el procedimiento de la
clonación molecular.
4. CLONACION DEL DNA
Comporta la separación de un gen
especifico o de un fragmento de DNA
de un cromosoma mucho mayor y su
unión a una pequeña molécula de
DNA portador, para después replicar
este DNA modificado miles o millones
de veces, mediante el aumento del
numero de células y la creación de
múltiples copias del DNA clonado en
cada célula.
5. ELEMENTOS
Segmento de DNA
Vector
- Plasmido
- Porción del genoma de un virus
bacteriano (λ)
Célula
Enzimas
6. ENZIMAS UTILIZADAS EN LA
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
ENZIMA FUNCION
Endonucleasas de restricción tipo II Cortan el DNA en secuencias especificas
DNA ligasa Une dos moléculas o fragmentos de DNA
DNA polimerasa I (E. coli) Rellena los huecos en el DNA duplex por adición
secuencial de nucleótidos en los extremos 3`
Transcriptasa inversa Hace una copia del DNA a partir de una molécula de
RNA
Polinucleotido quinasa Añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo
5`de un polinucleótido para marcarlo o para permitir
su ligación
Transferasa terminal Añade colas homopolimericas al grupo OH del
extremo 3`de un duplex lineal
Exonucleasa III Elimina nucleótidos de los extremos 5`de una hebra
de DNA
Exonucleasa del bacteriófago λ Elimina nucleótidos de los extremos 5`de un duplex
para exponer los extremos 3`monohebra
Fosfatasa alcalina Elimina fosfatos terminales tanto del extremo
5`como del 3`(o de ambos)
7. TIPOS DE
ENDONUCLEASAS
- Las del tipo I cortan el DNA al azar.*
- Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de
la secuencia de reconocimiento.*
- Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el
DNA en la misma secuencia de
reconocimiento.
* Se mueven a lo largo del DNA mediante un
mecanismo que requiere ATP
8. ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA
DNA Recombinante
Replicación del DNA recombinante dentro de
las células huésped
Aislamiento, secuenciación y manipulación del
fragmento de DNA purificado
9. CLONACION EN E. coli
E. coli fue el primer organismo utilizado y
todavía es la célula huésped mas común.
Tiene muchas ventajas:
- Se conoce bien el metabolismo de su DNA.
- Muchos vectores de clonación que se
encuentran asociados de manera natural,
están bien caracterizados
- Se dispone de técnicas efectivas para la
transferencia de DNA de una bacteria a
otra.
10. INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA
DE RESTRICCION EcoRV CON SU
SECUENCIA DIANA
Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA
en la secuencia reconocida por la endonucleasa.
La proteína se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La
enzima crea extremos romos. Átomos de Mg en naranja.
11. 1. Cortar el DNA en lugares
determinados. Las endonucleasas
especificas de secuencia
(endonucleasas de restricción)
hacen las veces de tijeras
moleculares.
2. Selección de una pequeña molécula
de DNA capaz de autoreplicarse.
Vectores de clonación (plásmidos o
DNA vírico).
3. Unión covalente de dos fragmentos
de DNA: La ligasa une el vector de
clonación y el DNA que se desea
clonar.
4. Traslado del DNA del tubo de
ensayo a una célula huésped que
proporcionara la maquinaria
enzimática necesaria para la
replicación.
5. Selección o identificación de las
células huésped que contienen DNA
recombinante.
12. CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.
Los
fragmentos
pueden
ligarse a un
plasmido
13. CORTE DE MOLECULAS DE DNA
MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Un fragmento sintético de
DNA que contenga las
secuencias de
reconocimiento de
varias endonucleasas
de restricción se
puede insertar en un
plásmido tratado
previamente con una
endonucleasa de
restricción
14. DISEÑO DEL PLASMIDO
pBR322
1. Posee un origen de replicación,
en el cual las enzimas celulares
inician la replicación (10-20
copias por célula)
2. Contiene dos genes que
confieren resistencia a
antibióticos.
3. Varias secuencias únicas de
reconocimiento para diferentes
endonucleasas suministran los
sitios donde cortar para insertar
las secuencias de DNA foráneo.
4. Su pequeño tamaño facilita su
entrada en la célula y la
manipulación bioquímica del
DNA.
15. CLONACION E IDENTIFICACION
DE DNA FORANEO EN E. coli
1. pBR322 se corta en el elemento de
resistencia a ampicilina.
2. El DNA foráneo se liga al pBR322
cortado. Si tiene éxito, el elemento
de resistencia a la penicilina es
inactivado.
3. Se transforman las células de E.
coli. Después se cultivan en placas
de agar que contienen tetraciclina
para seleccionar aquellas que han
incorporado el plásmido.
4. Las colonias individuales se
transfieren a posiciones
equivalentes de placas adicionales.
Una placa contiene tetraciclina y la
otra ampicilina.
16. Los plasmidos recombinantes se agregan a
un cultivo bacteriano que se trato antes con
iones de calcio.
Se someten a un breve golpe de calor y las
bacterias se estimulan para que capten el
DNA del medio.
El plasmido se replica en forma autónoma
en la célula receptora y se pasa a la
progenie durante la división celular.
17. CLONACION DE DNA EUCARIOTA EN
GENOMAS DE FAGOS
El DNA digerido se
fracciona por
electroforesis en gel
o centrifugación con
gradiente de
densidad y los
fragmentos de 20 kb
de largo (aprox) se
incorporan
18. EL FRAGMENTO LAMBDA
1. El DNA se empaca bien en una forma
que es facil de almacenar y extraer.
2. Todo paquete que contenga un DNA
recombinante es capaz de infectar
una celula bacteriana.
3. Una caja Petri puede contener mas
de 100,000 placas diferentes.
20. EL CROMOSOMA
ARTIFICIAL DE LEVADURA
Puede aceptar
segmentos de DNA
de hasta 1000 kb
Son versiones
artificiales de un
cromosoma
artificial de
levadura
21. APLICACIONES
El 24 de febrero de 1997 el Instituto Roslin, de Escocia, se
anuncia la reproducción con éxito de la oveja "Dolly".
En julio de 1997 los mismos científicos que habían clonado a
"Dolly" produjeron el cordero "Polly" que porta genes
humanos.
En noviembre de 2001 la empresa Advanced Cell Technology
(ACT) consiguió clonar el primer embrión humano de la
historia, aunque su desarrollo se detuvo de forma natural
cuando sólo contaba con seis células, mucho antes de
alcanzar la fase de blastocito, necesaria para obtener las
llamadas células madre. El objetivo era el de obtener células
madre para la investigación de terapias génicas.
En enero 2002, la empresa escocesa PPL Therapeutics
anuncia el nacimiento de unos cerditos, a los que se les pudo
eliminar el gen que causa que el sistema inmunológico del ser
humano rechace transplantes de los órganos del cerdo.
22. En enero de 2002, los creadores de la oveja Dolly, anuncian que el
animal sufre artritis, por el envejecimiento prematuro que padece, a
sus cinco años de edad.
En febrero de 2002 un equipo investigador que había clonado una
docena de ratones informó de que ninguno de ellos logró sobrevivir.
Además un equipo investigador japonés llamó la atención sobre la
mayor frecuencia de abortos, deformidades, sobrepeso y muertes
prematuras entre otros animales que habían sido clonados.
También en febrero de 2002, la Universidad A&M de Texas
presentó el primer gato clonado del mundo, un cachorro de dos
meses de edad al que llamaron "CC", siglas de "copia al carbón".
Según los científicos "los gatos tienen una forma felina del síndrome
de inmunodeficiencia humana que es un buen modelo para el
estudio del sida humano".
En noviembre de 2002 el experto italiano en fertilidad Severino
Antinori dice que espera que una paciente dé a luz un bebé clonado
en enero de 2003.
23. RATONES TRANSGENICOS
Se muestra un par de
hermanos de la misma
camada de 10 semanas
de edad.
El mas grande se
desarrollo con un huevo
inyectado con DNA + GH.
El mas grande pesa 44 gr,
y el pequeño 29 gr.
El gen GH se transmitió a
los descendientes.
24. BIBLIOGRAFIA
Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE
BIOQUIMICA. 4ª edicion. Edit. Omega. Pags. 306-
317.
Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
CELULA. 4ª edicion. Ediciones Omega. Pags. 500-
504.
Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR. 5ª edicion. Ed. Medica
Panamericana. Pags.
Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4ª
edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835
http://laguna.fmedic.unam.mx/lenpres/CH29.ppt#286
http://cultura.terra.es/cac/articulo/html/cac1321.htm