Este documento describe un estudio que examinó la penetración celular y procesamiento intracelular de una fusión de anticuerpo-rhGAA (FabGAA) y determinó su eficacia en el tratamiento de reemplazo enzimático en ratones GAA-KO. Los resultados mostraron que el FabGAA puede entregar eficientemente la proteína al citosol pero se necesita un mecanismo de protección para evitar su destrucción. El tratamiento de reemplazo enzimático no es eficiente para tratar la debilidad muscular porque disminuye el

1. Simón López Carvajal
Jaime Andrés Mejía Sánchez
UPB

2. INTRODUCTION

3. POMPE DISEASE
• ↓ acid α-glucosidase → ↑ of glycogen lysosomal.
• Incidence: 1/40.000 births.
• Children die from cardiorespiratory failure in the first year of life.
• Characterized by muscle weakness, hypotonia, hyporeflexia and a
hypertrophic cardiomyopathy in newborns.

4. ANTIBODIES
• Y - shaped protein.
• Produced by B cells as a primary immune defense.
• Neutralize pathogens such as bacteria and viruses recognizing it by
the antigen, via Fab.

5. GLYCOGEN
• Multibranched polysaccharide.
• Serves as a form of energy storage in humans, animals and fungi.

6. Lysosomal Cytoplasmic
THERAPY
• Use of recombinant humanGAA
(rhGAA)
• Receptor: Manose-6-phosphate
receptor (M6PR)= delivery of the
rhGAA to the lysosomes of target
cells.
• Fusion between the GAA and Fab of
the monoclonal anti-DNA
autoantibody 3E10.
• Receptor: equilibrative nucleoside
transporter 2 (ENT2)= It recognizes
the Fab. It´s an ideal vehicle for
cytoplasmatic delivery of therapuetic
GAA in muscle tissues of Pompe
disease.

7. FLOWCHART

8. OBJECTIVE
Examine the cell penetration and intracellular processing of the
antibody-rhGAA fusion (FabGAA) and determine its efficacy in
enzyme replacements therapy in GAA-KO mice.

9. MATERIALESY
MÉTODOS

10. FabGAA y rhGAA
• FabGAA fue suministrado porValerionTherapeutics
• La rhGAA fue obtenida de un médico que tuvo un paciente con
Pompe que murió durante un tratamiento de reemplazo
enzimático.

11. Captación de FabGAA en cultivos
• La captación de FabGAA fue realizada en cultivos de mioblastos L6
de ratones y en fibroblastos GSD ll del paciente.

12. Inmunofluorescencia
• Uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia
fluorescente para demostrar la presencia de una determinada
molécula.
• En este estudio la inmunofluorescencia se uso para observar el Fab
de los ratones y así poder ver la actividad de FabGAA.

13. Tratamiento de ratones GAA KO
con FabGAA
Ratones jóvenes
• Administración semanal de dosis
molares iguales de FabGAA (30
mg/kg, 6 ratones) o de rhGAA (20
mg/kg, 5 ratones)
• La administración fue durante 4
semanas
• Ratones control: ratones de la misma
edad que no fueron tratados, eran 6
• Difenhidramina: se inyecto de 10 a 15
min antes de cada administración
para prevenir reacciones
anafilácticas.
Ratones viejos
• Bajas dosis
• Administacion intravenosa (no
especifican donde) de FabGAA 30 mg/kg
una vez por semana durante 8 semanas
• 7 ratones UT(no tratados) se dejaron
como control, tenían la misma edad
seguramente pero ahí no dice.
• Altas dosis
• 7 ratones con 49 semanas de edad,
administración intravenosa de 90mg/kg
de FabGAA una vez por semana durante
4 semanas. 7 ratones UT(no tratados) que
seguramente tenían la misma edad
fueron usados como control
• Todos los ratones de este estudio eran
machos.

14. Recolección de la muestra tisular
• Sacrificaron a los ratones 48 horas después de la ultima inyección,
luego de un ayuno nocturno.
• A cada ratón le cogieron la orina y midieron el tetrasacarido de
glucosa urinario HEX 4, biomarcador de pompe.
• Cogieron una porción pequeña de cada tejido y la fijaron en un
buffer neutral de formalina al 10% para estudios histológicos, el
resto lo congelaron instantáneamente en hielo seco y lo guardaron
a -80° hasta el uso para análisis bioquímico.

15. Tinción de glucógeno tisular
Se hizo una tinción periódica acido-schiff (PAS).

16. Medicion de glucógeno tisular,
actividad de GAA y el Hex 4 urinario
Homogenizar
tejidos
congelados en
agua fría
Centrifugación
Lisados claros
obtenidos
fueron usados
para las
pruebas para
medir el
glucógeno y el
GAA.
El Hex 4 se
midió con
cromatografía
liquida y
espectrometría
de masas
tándem.

17. Western Blot
• Técnica que sirve para identificar proteínas especificas en una
mezcla compleja de proteínas como extractos celulares o tejidos.
• La técnica consta de tres etapas: separación por tamaño,
transferencia a un soporte solido y visualización mediante la
marcación de proteínas usando anticuerpos.
• En este estudio sirvió para poder ver el rhGAA,
FabGAA y sus interacciones con ENT2 y M6PR.

18. Determinación de la capacidad de
FabGAA para degradar glucógeno in
vitro a ph neutro.
• Los autores hicieron varias soluciones de glucógeno con los buffers
citrato y fosfato, con valores de ph que van de 3,5 a 7,0.
• A cada ph se realizaron reacciones triplicadas que contenían
solución de glucógeno y FabGAA y fueron incubadas a temperatura
ambiente por una hora. Las cantidades de glucosa generadas en las
reacciones fueron cuantificadas usando un kit de glucosa oxidasa.
• La actividad glucosidasa de FabGAA se expreso en nmol de glucosa
liberada / minuto / mg de proteína (nmol/min/mg).

19. RESULTADOS

24. DISCUSSION

25. Author What they said… Student’sOpinion
Grifin JL(1984) Muscule fiber destruction after lysosomal
rupture. Hypothesis that suggests that with
disease progression, movement and increased
myofibril rigidity during contraction cause
enlarged lysosomes to rupture and release
glycogen and lytic enzymes into the cytosol,
which subsequently cause damage to the
structure of muscle cells.
We agree, because this could explain
why the patients show muscular
weakness.
Raben N et al M6PR is the major cell-surface receptor through
which therapeutic rhGAA is delivered from the
circulating system to lysosomes in cells during
ERT of Pompe patients.
We agree, because for example in the
liver, the AGG concentrations were
higher in the lysosome and the liver has
very high levels of M6PR.
Hansen JE et al,
Pennycooke M et al
The unique monoclonal antibody 3E10 and its
fragments are capable of penetrating living cells
to deliver functional proteins to the cytosol and
nuclei via ENT2, a cell-surface transporter that
is highly expressed in human skeletal and
cardiac muscle.
We agree, because when they
measured the FabGAA in GSD ll
fibroblast with the M6P competitive
inhibitor, the amount of lysosomal
forms of GAA decreased, but the
amount of FabGAA didn’t decrease.
Weisbart RH et al Fab fragment has been shown to be able to
deliver a 305 kDa protein efficiently into
cultured cells.
We certainly disagree, because it was
showed that fab did deliver the protein
to the cytoplasm but the protein was
destroyed there because of its
instability, so it is not very efficient
since Fab doesn’t protects the protein.

26. CONCLUSIONS

27. • Fab is efficient to deliver the protein to the cytoplasm but a
protection mechanism is needed to prevent the protein destruction
related to its instability.
• The enzyme replacement therapy is not efficient to treat the
muscular weakness because it decreases the lysosomal glycogen
but not the cytoplasmic, which causes the damage of the muscular
fiber.

28. • From the tests shown between old and young mice, we can see
that it is better to start applying the therapy at an early age, since
at an older age there is a bigger ineffectiveness of the treatment
and therefore we have to apply higher doses, due to muscle
wasting.
• An in vivo experiment should be performed to evaluate the
effectiveness of FabGAA at a more basic pH, such as cytoplasmic,
to corroborate the results that were given in vitro.