Este documento describe el método de purificación de gamma globulina mediante precipitación con sulfato de amonio al 33% de saturación. Se explica que este método se basa en la disminución de la solubilidad de las proteínas con el aumento de la concentración de sales. La gamma globulina purificada se utilizará para inmunizar conejos. El proceso implica la adición de sulfato de amonio al suero humano total, centrifugación, disolución del precipitado y diálisis contra una solución salina reguladora de boratos para eliminar

1. INSTITUTO POLITÉCNICO
NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR
PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO
Jaimes Silva Lesslie Itzel
6QV1

2. ANTECEDENTES
• Tiselius y Kabat (1939) sometieron a electroforesis el suero de conejos inmunizados
con albumina de huevo y demostraron que la actividad de anticuerpo se encontraba en
el tercer pico del desplazamiento electroforético de las proteínas.

3. INMUNOGLOBULINAS
• Proteínas de estructura globular sintetizadas por células del sistema inmune (linfocitos
B y células plasmáticas).
• Capaces de reconocer a otras moléculas (antígenos) de manera muy específica, y
formar complejos estables con ellos (inmunocomplejos).
• Su aparición en plasma forma parte de la respuesta inmunológica adaptativa, en lo que
se conoce como respuesta humoral específica.
• Existen 5 tipos básicos de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, basado en el
número de unidades gamma y en el tipo de cadena pesada.

4. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
Métodos
Específicos
Basados en la propiedad
de los Ac de reaccionar
con sus antígenos
Inespecificos
Basadas en las
propiedades
fisicoquímicas de los
anticuerpos

5. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
• Principios de la precipitación de proteínas
Principio Agente precipitante
Disminución de la
solubilidad
-Sales (Sulfato de amonio)
-pH (precipitación
isoeléctrica)
-Solventes (etanol)
Desnaturalización selectiva -Temperatura
-pH
-Solventes
Afinidad -Ligandos
Métodos inespecíficos

6. PRECIPITACIÓN POR SALES
• PRECIPITACIÓN POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD
• El aumento de la concentración de iones en el solvente conduce a una mayor interacción
proteína-proteína, y la consiguiente disminución en su solubilidad.
• Cada proteína precipita a una cierta concentración de sales, y las diferencias entre las
proteínas son aprovechadas para lograr su separación.
• Los factores más importantes en este proceso son el pH, la temperatura y la concentración
de proteínas
• Para las inmunoglobulinas se utiliza un pH cercano a su punto isoeléctrico promedio,
usualmente entre pH 7 y 8. (7.8)

7. PRECIPITACIÓN POR SALES
• FUNDAMENTO

8. DIÁLISIS
• Es un proceso que separa moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo
de membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las
macromoleculares.
• Las moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al fluido externo hasta que se
alcanza el equilibrio, las macromoléculas permanecerán en el interior de saco de diálisis

9. OBJETIVO
• Efectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a
una saturación final del 33%.
• La gamma globulina obtenida en esta práctica se utilizará posteriormente para
inmunizar conejos.

10. MÉTODO
Solución saturada de
sulfato de amonio
 Ajustar el pH a 7.8
con NaOH 2N
Suero
Humano
Total (SHT)
(NH4)2SO4
saturado
3 mL 1.5 mL
4 mL 2 mL
(NH4)2SO4
a una saturación
del 33%
 Lentamente y con
agitación
 Continuar la
agitación durante
10-15 min.
 3500 rpm / 15 min
 Temperatura ambiente
 Disolver el sedimento
en SS pH 7.8 hasta
alcanzar el volumen
original del suero
 Decantar

11. MÉTODO
Suero
Humano
Total
(SHT)
(NH4)2SO
4
saturado
3 mL 1.5 mL
4 mL 2 mL
 Lentamente y con
agitación
 Continuar la
agitación durante
10-15 min.
 Disolver el sedimento
en SSRB hasta alcanzar
la mitad o un tercio del
volumen original del
suero
 3500 rpm / 15 min
 Temperatura ambiente
Solución salina
reguladora de boratos
(SSRB)
 Dializar contra SSRB en
frío (4°C) y con
agitación durante 3-5
días
 Realizar 2 cambios
diarios de SSRB hasta
eliminar el (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 + BaCl2  NH4Cl + BaSO4 ↓

12. RESULTADOS
• La solución de gamma globulina deberá ser ligeramente opalescente y su análisis por
inmunoelectroforésis deberá revelar un solo arco de precipitación localizado hacía el
polo negativo, revelando con un humano total.

13. Inmunoelectroforésis
RESULTADO
S
Suero
Humano Total
Albúmina
sérica
humana
Gammaglobulina
comercial
Gammaglobulina
purificada
+

14. CONCLUSIONES
• El método de purificación de gammaglobulinas mediante el uso de sales inorgánicas
ofrece ventajas sobre otros métodos como la simplicidad, el bajo costo, la rapidez y el
alto rendimiento final.
• La SSRB elimina el exceso de sales, previene el crecimiento microbiano y evita la
contaminación de la gamma globulina.

15. BIBLIOGRAFIA
• Ricardo Martínez Rodríguez, “Fundamentos teóricos y prácticos de la histoquímica”, Madrid, 2011, pág 219-232
• http://bdigital.dgse.uaa.mx:8080/xmlui/bitstream/handle/123456789/279/396599.pdf?sequence=1&isAllowed=y
• http://farmupibi.blogspot.mx/2015/03/produccion-de-anticuerpos-contra.html
• http://ufq.unq.edu.ar/docencia-virtual/bqblog/dialisis%20y%20ultrafiltracion.pdf
• http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
• https://www.uv.es/jcastell/2_anticuerpos.pdf
• file:///c:/users/hp/downloads/s1699258x09002010_s300_es.pdf
• http://www.kerwa.ucr.ac.cr/bitstream/handle/10669/9244/2007_manual_metodos_inmunologicos_completo_web.pdf?
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