1. PRACTICAS LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA
Daniel Vidal Santana
1º Enología

2. La microbiología enológica es una disciplina imprescindible de conocer
a la hora de la vinificación, ya que de las levaduras depende principalmente la
misma, y aún siendo así, no se le presta la atención necesaria, por regla general
dentro de la bodega, exceptuando las grandes bodegas, los bodegueros
inoculan levaduras y bacteria comerciales, una vez inoculado no se suele llevar
un control microbiológico de la fermentación, dejando que simplemente
fermente sin saber que tipo de microorganismo actúa, condiciones del medio
para la célula, evolución de las mismas, población bacteriana (perjudiciales y
favorables), etc. Por ello las prácticas de microbiología son imprescindibles en
la formación de un enólogo para poder usar todos estos conocimientos a la
hora de crear un vino. Teniendo en cuenta la diversidad de procedencias que
tienen los alumnos de enología es necesario empezar por lo más simple, e ir
poco a poco aprendiendo como llevar el control microbiológico en bodega.
La primera práctica desarrollada consistió en la preparación de medio
de cultivo, imprescindible para poder aislar microorganismos y su posterior
estudio, aprendimos a realizar dos medio complejos, un medio adecuado para
levadura y otro para bacterias lácticas, el medio destinado al aislamiento de
levaduras es el llamado YPD (Yeast, Peptone, Dextrose) al que además de los
compuestos necesarios para prepararlo, se añade tetraclina para evitar el
desarrollo de bacterias en el mismo; el medio de cultivo realizado para
bacterias lácticas se conoce como MRS (DeMan, Rogosa y Sharpe), este se
encuentra comercializado y se rehidrata siguiendo las instrucciones del
fabricante, para evitar el crecimiento de levaduras se añade actidiona. Se
prepararon para estas dos condiciones los tres tipos de soportes sólidos para
el medio de cultivo, tubos de agar inclinado, tubos en picadura y placas petri
de cultivo en superficie, estos últimos fueron los más utilizados en posteriores
prácticas. Una vez preparados los medios se procedió al aislamiento de
levaduras y bacterias, pudiendo obtener aislados de microorganismos en
forma de cultivos puros, y con una serie de diluciones obtener colonias
aisladas a partir del mosto en las placas petri, pudiendo conocer así el numero
de unidades formadoras de colonias obtenidas, calculando la concentración de
células vivas. Teniendo ya aisladas las levaduras y bacterias de nuestro mosto,
a partir del cual realizaremos la vinificación, procedemos al recuento de células
viables y totales, para el conocimiento de células viables (c.f.u./ml) se cuentan
las colonias por placa y se divide por el factor de dilución y el volumen de la
placa; el recuento de células totales se determinará con la cámara Thoma, es
un porta modificado con una hendidura de 0,1mm de profundidad, dividida
en 16 cuadrados y estos en 16 celdillas, contamos 4 cuadrados al azar y
calculamos una media de células por cuadrado, si dividimos esta media por el
volumen de cada celdilla tendremos la concentración de células por ml de
muestra, gracias a esta medida podemos, si hemos hecho un cultivo de
levaduras autóctonas de nuestra zona, inocular la cantidad necesaria para una
fermentación correcta. A partir de las placas que usamos para el recuento se
aislaran levaduras y bacterias en función de la morfología y así purificarlas.

3. Una vez hemos aislado, purificado y hecho el recuento de nuestras
células, se llevan acabo la identificación de estas por distintas pruebas
taxonómicas, son: Fermentación de azucares por levadura, se basa en las
observación de la producción de gas por parte de las levaduras en medios con
distintos tipos de azucares y así conocer gracias a la tabla de las características
principales de la especie Saccharomyces, el tipo de levadura Saccharomyces
que tenemos. Reacción de la catalasa, esta prueba es valida tanto para
levaduras como para bacterias, es una prueba sencilla basada en la capacidad
de descomponer agua oxigenada gracias a la presencia de catalasa, los
microorganismos que carecen de ella no son capaces de esta descomposición,
consiste en la observación de la producción de burbujas al añadir una gota de
agua oxigenada, si observamos burbujas la prueba será positiva y viceversa, las
bacterias lácticas carecen de catalasa y serán catalasa -, las levaduras son
catalasas +. Metabolismo fermentativo, prueba utilaza en identificación de
bacterias del ácido láctico, estas las podemos subdividir en tres grupos
bioquímicos distinguibles por los productos formados a partir de glucosa,
pudiendo ser Homofermentativa obligada, homefermentativa facultativa y
heterofermentativa obligada, esta prueba es muy útil, ya que no todas las
bacteria lácticas son favorables a la hora de vinificar, determinadas bacterias
pueden dar influencias desfavorables en la estabilidad y las cualidades
organolépticas del vino. Observación microscópica, preparación de las
muestras y observación al microscopio estudiando su forma y tamaño.
Tinción de Gram, Usado para bacterias, método por el cual gracias al
diferente color, observado al microscopio, que tomen las bacterias tras la
tinción sabremos si son gram positivas o negativas, las bacterias gram-
positivas se ven de color azul/violeta, y las gram-negativas de color rojo/rosa.
Otras prácticas realizadas y que nos darán información de nuestro
proceso son la estimación turbidiométrica del crecimiento celular y la
conjugación de levaduras, por estos dos análisis sabremos el estado y tipo de
desarrollo que tendrá nuestro proceso; gracias a la practica por turbidiometría
estimaremos la curva de crecimiento de la población microbiana, basado en la
dispersión de la luz que atraviesa la suspensión de nuestras levaduras, ya que la
turbidez es proporcional al numero de células y se puede medir usando un
espectrofotómetro. La conjugación de levaduras es importante para la
comprensión de la multiplicación de forma asexuada (vía vegetativa), o bien
de manera sexuada, formando ascosporas; así esta práctica es una buena
forma de comprensión e introducción, a mí entender, a la micromanipulación.
Como última práctica se realizo un análisis de los diferentes ensayos
sobre las cepas seleccionadas en cuanto a su capacidad para realizar la
fermentación maloláctica, la evolución en el contenido de ácido málico y
láctico se realizó, cualitativamente, por medio de cromatografía líquida
(HPLC), y cuantitativamente por medio de kits enzimáticos (Boehringer
Mannheim). Para la Cromatografía líquida, se tomo una alícuota de una
muestra de 1 ml filtrada a través de membrana, y haciéndola pasar por una

4. columna de intercambio catiónico, arrastrado por una fase móvil, los
componentes de las muestras fueron detectados e identificados en base a su
tiempo de retención, gracias a una detector de ácidos y un detector del índice
de refracción; La determinación por kits enzimático, se realizo basándose en la
reacción de oxidación de L-malato a Oxalacetato, la cantidad de ácido málico
presente se deduce midiendo la cantidad de NADH formado por la reacción
de oxidación del L-Malato, la cantidad de NADH se obtendrá midiendo la
absorción de luz a una longitud de onda de 340nm.
Mi conclusión sobre las prácticas a sido satisfactoria, ya que son las
primeras practicas de microbiología que he realizado y creo haber obtenido
los conocimientos básicos necesarios para poder realizar un estudio
microbiológico, habiendo ayudado para ello la realización de las practicas
conjuntas de las asignaturas microbiología y química enológica, en la cual
seguimos el control de nuestra propia vinificación y la aplicación de lo
aprendido en las practicas realizadas con anterioridad en esta asignatura de
microbiología enológica.