análisis microbiológico del agua

Análisis Microbiológico del agua
- Análisis microbiológico del agua -
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Parámetros biológicos del agua………………………………. 2
Determinación de microorganismos aerobios mesófilos....... 4
Determinación de Coliformes Totales y Fecales ………....... 5
Determinación de Estreptococos Fecales…………………...12
Determinación de Clostridios Sulfito Reductores…………...15
Conclusiones del análisis……………………………………...17
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Parámetros biológicos del agua:
El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran
número de actividades humanas. Su creciente degradación por disminución de
su calidad implica la reducción del número de usos que se le da; es por ello, lo
que se hace necesario la realización de estudios que permitan determinar la
calidad de ese agua. Los análisis que se pueden realizar al agua para controlar
su calidad son: físicos, químicos y microbiológicos, en esta ocasión se hará una
determinación microbiológica.
Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en
el momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si
tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones
transitorias introducidas por el ser humano; si su crecimiento lo propician los
nutrientes presentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales
municipales o lo frenan los venenos procedentes de la actividad agrícola o
industrial; y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales
superiores.
Se debe conocer la forma de los patógenos hídricos y determinar su
presencia y origen, la magnitud y oscilación de su número, el curso de su ciclo
vital y el índice de su supervivencia. Los parámetros biológicos en las aguas
potables son de mucho interés, los microorganismos que puede haber en el
agua son virus, bacterias, hongos, algas y protozoos. Aquellos que son inocuos
para el hombre no tienen significación sanitaria, por lo que el control
microbiológico del agua se va a centrar en las especies patógenas para el
hombre. Dado que buscar todo tipo de microorganismos patógenos, por su
diversidad, es costoso y complicado y como la relación patógenos/no
patógenos es muy pequeña, se realiza un control del agua a través de
indicadores microbiológicos de contaminación.
Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad
de un agua. Así, según predominen unos organismos u otros, podremos saber
el estado de un agua.
Para que un microorganismo sea considerado como indicador
microbiológico ha de reunir unas condiciones que son:
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∗ Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua.
∗ Debe tener una supervivencia en el agua superior a los
organismos patógenos.
∗ Debe soportar mejor a los desinfectantes.
∗ Deben ser fáciles de aislar, identificar y contar.
∗ Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios.
La normativa recoge una serie de análisis microbiológicos según se
efectúe sobre el agua un análisis mínimo: Coliformes Totales y Fecales; uno
normal: los anteriores más: bacterias aerobias a 37 ºC, Estreptococos Fecales
y Clostridios Sulfito-Reductores; o completo: los anteriores más aerobias a 22
ºC, microoganismos parásitos y/o patógenos; el análisis realizado ha sido el
normal.
El agua problema procede de un manantial, vamos a realizar un análisis
microbiológico normal y el objetivo va a ser determinar la contaminación
microbiológica que puede existir, buscar las causas de esa contaminación y
proponer soluciones al problema.
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Determinación de microorganismos aerobios mesófilos:
Se determinarán estos microorganismos que son los que se encuentran
a temperatura ambiente en el agua.
Procedimiento:
El método consiste en filtrar a vacío una determinada cantidad de agua
que va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante estéril depositada con la
cuadrícula hacia arriba.
Una vez filtrada el agua, se retira la membrana y se deposita con pinzas
estériles sobre una placa Petri con medio P.C.A., se incuba 37 ºC 24 -48
horas.
Tras la incubación se realiza un recuento de las colonias aparecidas,
expresándose el resultado en u.f.c. en 100 mL.
Resultados obtenidos: recuento de colonias:
Al transcurrir el período de incubación establecido se saca la placa de
Petri de la estufa y se recuentan las colonias crecidas.
El número de colonias aparecidas es 270 u.f.c. por cada 100 mL de agua
problema.
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Determinación de Coliformes Totales y Fecales:
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales,
capaz de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los
totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en
heces están formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya
que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia
de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su
capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica
que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes
fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica,
pH, humedad… Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador
ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación
de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica
que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades.
Procedimiento:
Vamos a seguir el mismo método para la determinación de los dos tipos
de Coliformes, lo único que variará será la temperatura de incubación de cada
determinación, que para los Coliformes Totales será de 37 ºC y para los fecales
ha de ser de 44 ºC.
Prueba presuntiva:
Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo
BGBB (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya
que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los
Coliformes a la vez que permite que éstos crezcan sin restricción, se distribuye
el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno
de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos, 1
ml de agua a la segunda serie, y 0,1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo
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una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le
habrá añadido un indicador ácido-base.
Estos tubos se incuban a la temperatura correspondiente según se trate
de Coliformes Totales ó Fecales durante 24 horas.
Los Coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar
a la con producción de ácido y gas, estos signos serán los que buscaremos.
La reacción será positiva cuando se produce desprendimiento de gas en
la campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad, y el medio vira
a color amarillo debido a formación de ácido.
Una reacción positiva por débil que sea, indicará la presencia y
coliformes y habrá que hacer las pruebas confirmativas de IMViC.
Se aplicará la técnica del número más probable (NMP).
Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:
En los tubos donde se introdujo 0,1 ml de agua problema, o resultados
positivos en la prueba presuntiva ,se introduce un asa de siembra estéril y se
toma una porción que va a sembrarse en estría en una placa Petri con medio
EMB Levine. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben
parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, además
la combinación de azul de metileno y eosina permitirán diferenciar
microorganismos lactosa positiva de los negativos.
Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente
según se trate de Coliformes Totales ó Fecales.
Los Coliformes aparecerían como violetas oscuros y si hubiera
microorganismos lactosa negativos aparecerían como colonias incoloras.
Pruebas IMViC:
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden
identificarse a través de una serie de pruebas bioquímicas, que permiten
determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso
permiten determinar la existencia de una secuencia metabólica. Con este fin se
han desarrollado diversos esquemas de clasificación, uno de los más
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conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarrolló para clasificar
especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de
bacterias coliformes (bacterias aeróbicas o anaeróbicas facultativas, Gram
negativos, bacilares, no esporógenas que producen ácido y gas durante la
fermentación de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas:
- Indol:
El triptófano, aminoácido suministrado por una peptona adecuada, se
descompone en indol por acción de algunos microorganismos.
La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de
producir indol cuando está en presencia de agua de peptona. El indol producido
es detectado por indol de kovacs que produce una coloración al reaccionar con
él.
Se coge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se
siembra en un tubo con agua de peptona.
Se incuba horas a la temperatura correspondiente según se trate de
Coliformes Totales ó Fecales, 24-48 horas, pasado el tiempo de incubación se
sacan los tubos de la estufa y se les añade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y
se deja reposar.
Si aparece una coloración roja indica que la prueba es positiva, el
microorganismo produce indol.
- Rojo de metilo:
Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento
de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampón fosfato.
Debido a la acidez producida, el medio virará de amarillo a rojo
considerando la prueba positiva al añadir un reactivo.
El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferncia que, en
vez de añadir indol de kovacs, añadimos Rojo de Metilo.
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- Voges Proskauer:
Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en
la degradación de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de
KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con α-naftol y un
producto de descomposición de la arginina de la peptona, para producir un
color rojo.
En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias
aparecidas en las placas EMB Levine.
Se incuba a 37 ó 44 ºC 24-48 horas, luego se añade 1 mL de reactivo de
Voges Proskauer,que contiene α-naftol y KOH, se añade seis gotas de reactivo
o´mehara y dos de reactivo de Barry, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y
si aparece una coloración roja la prueba es positiva.
- Citrato:
Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo
problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono.
En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una
colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estría. Si aparece crecimiento
en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la producción de
amoníaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo.
Tinción de Gram:
La coloración de Gram tiene fundamental importancia en la
diferenciación morfológica y taxonómica de las bacterias. Las bacterias se
clasifican en dos grandes grupos según retengan o no el colorante de base
usado en la tinción, que es el violeta de genciana o el cristal violeta:
• Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teñido
uniformemente de color azul o violeta.
• Las bacterias Gram negativas se tiñen de rojo por el colorante
usado como contrastador, fuchina, safranina.
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La diferencia entre unas y otras radica en la composición química de la
pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram negativas es más
delgada y presenta un contenido en lípidos, grasas, diez veces superior que el
de las Gram positivas, lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante en
el citoplasma.
Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos
una tinción diferencial, a continuación observamos con el microscopio.
Resultado de la determinación:
Se han obtenido idénticos resultados tanto en la determinación de
coliformes totales como fecales y éstos han sido:
Prueba presuntiva:
En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de
violeta a amarillo debido a la producción de ácido y en la campana Durhan
puede apreciarse con bastante gas en su interior. Los resultados son positivos
en 2 de los 3 primeros tubos,2 de los 3 sundos y 1 de los 3 últimos (viraje del
medio y gas); con estos datos vamos a las tablas del número más probable
(NMP) y tenemos:
Más de 20 u.f.c. por cada mL de agua problema.
Como ésta prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas
confirmativas, de haber resultado negativas las primeras, daríamos por
terminado el análisis.
Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:
Tras la incubación han aparecido
colonias de color violeta, tal y como se
esperaba. Se pasa a las pruebas de IMViC
para determinar el microorganismo existente.
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Pruebas IMViC:
- Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al
tubo: Indol positivo:el microorganismo produce
indol.
En la figura aparecen de izquierda a
derecha: tubo sin inoculación de bacterias,
resultado negativo y resultado positivo a la
derecha.
- Rojo de Metilo: Tras la incubación de
cuatro días, se añade el reactivo y el tubo se
colorea de rojo: Rojo de metilo positivo; el
microorganismo produce acidez en su
crecimiento. En la figura aparecen de izquierda a
derecha: tubo sin inoculación de bacterias,
resultado negativo y resultado positivo a la
derecha.
- Voges-Proskauer: El microorganismo no
produce acetilcarbimol al añadirle el reactivo que
se detecta con la aparición del color rojo, en este
caso el resultado es negativo, (tubo del medio).
En la figura aparecen de izquierda a derecha:
tubo sin inoculación de bacterias, resultado
negativo y resultado positivo a la derecha.
- Citrato: Tras la incubación se observa que el microorganismo no ha
crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color,
por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato.
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El viraje del color del medio se debería a
una producción de amoníaco que alcalinizaría el
medio y se habría detectado este aumento de
pH con el viraje del color del indicador que
incorpora el medio de cultivo. En la figura
aparecen de izquierda a derecha: tubo sin
inoculación de bacterias, resultado negativo y
resultado positivo a la derecha.
El resultado de las pruebas IMViC son:
++--; con esta combinación vamos a una tabla y como resultado tenemos que
el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia Coli.
I M VI C
Escherichia Coli + + - -
Tinción de Gram:
Con esta prueba, hemos observado bacterias bacilares Gram negativas
con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a
estas características y es el mayor indicador de contaminación fecal en el agua.
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Determinación de Streptococcus Fecales:
Los Streptococcus Fecales son bacterias anaeróbias o aeróbias
facultativas, conocidas como bacterias del ácido láctico, integrantes de la flora
normal de los animales homeotérmicos. Actualmente se considera que
pertenecen al género Enterococcus .
Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones
ambientales adversas altas o bajas temperaturas, deshidratación, salinidad, luz
solar…), por lo que se suelen emplear para determinar la contaminación fecal
en aguas de baño marítimas, pues son las que mejor soportan esas
condiciones de salinidad.
Los Streptococcus son abundantes en heces de animales, por lo que
son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la cría de ganado. Nuestra
muestra de agua problema está tomada en este ambiente por lo que es
importante realizar esta prueba.
Procedimiento:
Prueba presuntiva:
Para determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de
cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida), que es un caldo de
enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield.
En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida sódica
inhiben el crecimiento de la flora acompañante, mientras que los Streptococcus
crecen sin restricción.
A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y
esculetina la cuál reacciona con el NH4
+
que lleva el medio y Fe+3
para dar un
complejo verde negruzco.
Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra
problema y lo incubamos 24 horas a 37 ºC. Si aparece ennegrecimiento, la
prueba presuntiva es positiva y se pasará a las confirmativas.
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Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar:
De los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra
en estría múltiple en placas KAA Agar, las que se incuban a 37 ºC 24-48 horas.
Si pasado el periodo de incubación aparecen colonias rodeadas de halos
negros debido a la hidrólisis de la esculina confirmaremos la presencia de
Streptococcus Fecales.
Otras pruebas confirmativas:
- Tinción de Gram:
En el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observarán
cocos Gram positivos.
- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI:
Se trata del caldo Cerebro-corazón que tiene la característica que
contiene una concentración en NaCl de 6,5%. Los Streptococcus crecen en
medios con elevada concentración en sales minerales, es por lo que son índice
de contaminación fecal en agua marina, como ya se ha comentado
anteriormente.
- Prueba de la catalasa:
Consiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el
agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxígeno (O2). Los
Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y
no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno lo que nos
indicaría que se ha reacción se ha producido.
Para realizar esta prueba se efectuará un frotís con las colonias
aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus, en un portaobjetos y nunca con
colonias de medios que contengan Azida sódica.
Una vez fijada la extensión se añade H2O2, si aparece un burbujeo, la
prueba de la catalasa será positiva.
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Prueba presuntiva:
Aparece un ennegrecimiento en el tubo, la prueba es positiva.
Los Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y
esculetina, la cuál reaccionan con el NH4
+
que lleva y Fe+3
para dar un
complejo verde negruzco.
Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar:
La prueba resulta positiva: Aparecen colonias rodeadas de halos negros
debido a la hidrólisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de
Streptococcus Fecales.
Otras pruebas confirmativas:
- Tinción de Gram:
Se observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma
teñido uniformemente de color azul o violeta.
- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI:
La prueba es positiva, aparece en el medio de cultivo, los Streptococcus
han crecido en este medio rico en NaCl.
- Prueba de la catalasa:
La prueba ha resultado negativa, es decir, los Streptococcus no tienen la
enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2.
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Determinación de Clostridios Sulfito Reductores:
Los Clostridios son un género de bacterias que se caracterizan por
producir esporas terminales que deforman los bacilos. Son anaerobias y Gram
positivos. Estos microorganismos son importantes por los daños que pueden
provocar en las personas y por los beneficios económicos que reportan.
Los géneros pertenecientes al género Clostridium tienen la característica
común de poder reducir el sulfito a sulfuro, los Clostridios sulfito reductores se
usan en ocasiones como índice de contaminación fecal, sobretodo para
apreciar la calidad higiénico-sanitaria del agua y productos animales ó de
origen animal.
Este tipo de microorganismos pueden esporas, lo que les confiere una
gran resistencia.
La detección se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en
medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro,
dando lugar, en presencia de hierro, sulfuro de hierro que es de negro, con lo
que la aparición de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito
reductores.
La detección y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer
de dos formas:
- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas y
esporuladas conjuntamente.
- Investigando la presencia de formas esporuladas.
Se va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas y
esporuladas conjuntamente.
Procedimiento:
Determinación de formas esporuladas y viables:
Se va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-
Sulfadiazina (SPS).
Lo primero será preparar una serie de diluciones decimales.
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Se preparan dos tubos con medio, donde se sembrará con pipeta estéril
en un tubo, un mL de la dilución 10-2
y en otro tubo un mL de la dilución 10-3
.
La siembra se efectuará introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y
depositando el inóculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie. Una vez
solidificado el medio de cultivo se añaden 2 mL de ese mismo medio para crear
anaerobiosis.
Se incuba a 37 ºC 48 horas, y pasado el periodo de incubación se
cuentan las colonias negras aparecidas, ese número multiplicado por el factor
de dilución será el número total de formas vegetativas y esporuladas por
gramos ó mL de muestra.
En el tubo sembrado a partir de la dilución 10-1
se observa 1 colonia
negruzca.
En el tubo sembrado a partir de la dilución 10-2
no se observa ninguna
colonia.
El número total de formas vegetativas y esporuladas será:
1 colonia * 10 (Inverso del factor de dilución) =
10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problema.
El color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han
reducido el sulfito a sulfuro, que reacciona con el Fe+2
del medio formando FeS
que es negro, por eso las colonias aparecidas son negras.
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Conclusiones del análisis:
El agua constituye un elemento esencial, ya que es indispensable para
la vida, por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad. Con este
análisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un
manantial.
El reglamento que regula la calidad de las aguas (R.D. 140/2003 del 7
de Febrero (B.O.E. nº 45 de 21/2/2003)) establece unos límites de
contaminación que no pueden ser superados y como puede observarse con los
resultados obtenidos, el límite se supera ampliamente.
BACTERIAS A. M. : 200 u.f.c. / mL
COLIFORMES: 0 u.f.c. / 100 mL.
E. COLI: 0 u.f.c. / 100 mL.
ESTREPTOCOCOS FECALES : 0 u.f.c. / 100 mL.
CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: 0 u.f.c. / 100 mL.
Como resultado hemos obtenido una gran contaminación microbiológica
del agua, donde no debería aparecer ningún tipo de contaminación puesto que
se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo
humano, aunque actualmente se conocía la no potabilidad de la misma.
Durante años se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua
analizado y comparando resultados vemos que los parámetros biológicos se
alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momento.
La causa presumible es la ubicación de unas grandes instalaciones
ganaderas, a pocos metros de distancia, de donde se encuentra el manantial
del agua analizado que originarían la contaminación.
Es normal que aparezca una contaminación fecal en el agua y la
presencia de Escherichia Coli, que es el mejor indicador de este tipo de
contaminación, así lo confirma.
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El problema de la no potabilidad del agua sería solucionado con una
buena gestión de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al
manantial a un tratamiento de potabilización.

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