HPLC-ED

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Universidad de Los Andes

Facultad de Ciencias

Departamento de Química

Laboratorio de Electroquímica

DETERMINACIÓN DE UN ANALITO ORGÁNICO EMPLEANDO UN
DETECTOR ELECTROQUÍMICO PARA HPLC.

ESTUDIO TEÓRICO, EVALUACION EXPERIMENTAL DE LA
ELECTROACTIVIDAD OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS Y
CONFIGURACIÓN DE CELDA

Por Roberto Antonio Quintana Agostinelli

Trabajo presentado como requisito para la obtención de la Licenciatura en Química ante la
Ilustre Universidad de Los Andes

Mérida, Marzo del 2011

Este trabajo fue realizado en la Universidad de Los Andes, Facultad de
Ciencias. Laboratorio de Electroquímica, bajo la tutoría de los Dres. Ricardo
Hernández e Yris Martínez.

A mis padres, familiares y amigos

“Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la
electricidad y la energía atómica: la voluntad”
Albert Einstein

AGRADECIMIENTOS

A Jehová, divino proveedor de todo cuanto existe

A mis padres, pedestales de mis esfuerzos y fuentes inagotables de alegría y
fortaleza

A mi familia, mis abuelos, tíos y primos, quienes siempre han estado presentes
con su amor, cariño y comprensión

A mis Profesores Dr. Ricardo Hernández y Dra. Yris Martínez por todo el apoyo
y comprensión brindada

A los Profesores Andrés Abad, Enrique Millán, Luis Rincón y Marcos
Rodríguez.

Al personal técnico del CITEC

Al Grupo de Electroquímica y al Departamento de Química

A todos y cada uno de los compañeros del Laboratorio de Electroquímica, por
todo su apoyo y compañerismo

A todos mis compañeros de infancia del Colegio La Salle de Mérida y de
Santiago de Chile, así como también a todos sus Profesores, quienes guiaron
los primeros pasos de mi formación

A todos los seres extraordinarios que he tenido la dicha de conocer, algunos de
ellos, los amigos del alma Andrés Hocevar, Amal Rosaly, Maria Carolina
Maninat, Roberto Guarnieri, Rotke Monsalve, Damirya Prieto, Miussett Rivas,
Roberto Giusti, Jani Mohamed, Eliana Montero, Aureliano Prieto, Zuely
Facchin….

A las Profesoras Maribel Valero y Sonia Koteich, estimadas y apreciadas
jurados del presente trabajo.

RESUMEN

El presente trabajo especial de grado, se reporta la construcción de un nuevo
detector en acero inoxidable, partiendo de un diseño previo manufacturado en
plexiglás, en el Laboratorio de Electroquímica como continuación de una línea
de investigación iniciada en el año 2005 relacionada con el diseño, fabricación,
caracterización y puesta a prueba de detectores electroquímicos. La celda fue
construida para ser empleada en la determinación de analitos orgánicos; en
este caso específico de la (10R,11R,15R,16R)-16-hydroxi-10-(3,4,5-
trimetoxifenil)-4,6,13-trioxotetraciclo[7.7.0.03,7.011,15]hexadeca-1,3(7),8-trien-12-
ona (podofilotoxina). Con este propósito se evaluó la electroactividad del analito
propuesto mediante dos aproximaciones; en primer lugar por medio de un
programa gratuito de modelaje molecular (ARGUSLAB) y luego
experimentalmente mediante voltamperometría cíclica. El modelaje molecular
indicó que el analito era “teóricamente” susceptible de sufrir procesos de
oxidación en un intervalo de potenciales razonablemente bajo; la evaluación
experimental confirmó este resultado. Seguidamente se procedió a la
caracterización del detector o celda de capa fina (CCF) mediante una serie de
evaluaciones realizadas en celdas electroquímicas semi-infinitas (CSI) y
comparadas con las obtenidas con la CCF. La fase experimental de
caracterización electroquímica del mencionado detector se realizó empleando
soluciones de ferrocianuro de potasio y sulfato de cobre, tanto en condiciones
estancas como dinámicas. El comportamiento electroquímico de ambas
especies, en la celda de capa fina, es similar al reportado en la literatura para
celdas electroquímicas de dimensiones semi-infinitas, presentando
desplazamientos característicos en los potenciales de media onda y las
corrientes de pico o corrientes límite, según sea el caso. Estos
desplazamientos son atribuibles principalmente a la ubicación espacial de las
líneas de campo presentes entre las superficies electródicas, en el detector de

capa fina. Para efectos de la verificación de la respuesta del detector
electroquímico, se comparó su respuesta instrumental contra la de un detector
UV-Vis comercial, empleando como analito podofilotoxina. Los resultados
obtenidos, demostraron que el detector electroquímico, operando bajo las
condiciones experimentales consideradas, requiere de posteriores
optimizaciones a fin de mejorar considerablemente su cociente señal / ruido, en
relación al obtenido con el detector UV-Vis comercial.

INDICE GENERAL

PÁGINA

Índice de ecuaciones………………………………………… ix

Índice de figuras……………………………………….…….. xi

Índice de tablas………………………………………………. xvii

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN

1.1. Introducción………………………………………………….. 2

1.2. Marco Teórico………………………………………………… 5

1.2.1. Electroquímica. Algunos Conceptos……………… 7

1.2.2. Vías para la determinación de la electroactividad…… 10

1.2.3. Generalidades de la Celda Electroquímica…………… 26

1.2.4. Técnicas electroquímicas semi-infinitas y justificación de las

celdas de capa fina………………………………………… 27

1.2.5 Antecedentes de la Electroquímica en Capa Fina……… 28

1.2.6. Justificación de la Celda Electroquímica de Capa Fina para HPLC..30

1.2.7. Celdas Electroquímicas de Capa Fina Comerciales y

No Comerciales………………………………………………… 31

1.2.8. Celdas de Capa Fina desarrolladas en el Laboratorio de

Electroquímica. Facultad de Ciencias. ULA………………… 32

1.2.9. Técnica Acoplada HPLC-ED………………………………….. 33

vi

1.2.10. Técnicas Cromatográficas………………………………… 36

1.2.11. El Analito Orgánico de interés…………………………….. 39

1.2.12. Electroquímica del 4´-desmetilpodofilotoxina……………. 41

1.3. Hipótesis…………………………………………………………………. 44

1.4. Objetivos………………………………………………………………….. 44

1.4.1. General…………………………………………………………… 44
1.4.2. Específicos………………………………………………………... 44

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA

2.1. Metodología…………………………………………………………………… 47

2.2. Reactivos, materiales y equipos…………………………………………….. 47

CAPÍTULO III. DETERMINACIÓN DE LA ELECTROACTIVIDAD

3.1. Determinación de la Electroactividad……………………………………….. 51

3.1.1. Simulaciones teórico-computacionales…………………………. .51

3.1.2. Determinación electroquímica de la electroactividad……………. 53

3.2. Pruebas de solubilidad de la podofilotoxina……………………………..….. 53

3.3. Selección del electrodo de referencia…………………………………… 54

3.4. Voltametrías de la podofilotoxina………………………………………………. 55

3.4.1. Empleo del electrodo de referencia de Ag/AgCl…………………… 56

3.4.2 Empleo del pseudo-electrodo de referencia de platino…………..… 56

vii

3.5. Resultados y discusiones. Determinación de la electroactividad………… 57

3.5.1 Simulaciones teórico-computacionales………………………......... 57

3.5.2 Seguimiento espectrofotométrico de la solubilidad de la

podofilotoxina………………………………………………………….. 67

3.5.3. Voltametrías de la podofilotoxina…………………………………. 68

CAPÍTULO IV. DISEÑO, MANUFACTURA Y VERIFICACIÓN DEL
DETECTOR

4.1. Diseño, manufactura y verificación del Detector………………………….. 74

4.1.1. Diseño del detector…………………………………………….... 74

4.1.2. Caracterización del detector electroquímico……………..…… 76

4.1.3. Determinación cualitativa de la podofilotoxina usando el

detector en modo amperométrico……………………………….. . 93

4.1.4. Acoplamiento del detector al sistema HPLC……………………. 97

4.1.5. Verificación y calificación de la respuesta del detector………….. 100

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

5.1. Conclusiones……………………………………………………………….. 105

5.2. Recomendaciones ………………………………………………………… 107

Referencias Bibliográficas……………………………………………………… 108

viii

ÍNDICE DE ECUACIONES

PÁGINA

Ecuación 1. Primera Ley de Fick……………………………... 8

Ecuación 2. Segunda Ley de Fick……………………………… 8

Ecuación 3. Primera Ley de Fick Modificada………………… 9

Ecuación 4. Segunda Ley de Fick Modificada……………… 9

Ecuación 5. Componente difusional de la ecuación de Fick en coordenadas
cartesianas……………………………………… 9

Ecuación 6. Ecuación de Schrödinger…………………… 14

Ecuación 7. Componente de energía cinética y potencial del operador
Hamiltoniano…………………………………… 15

Ecuación 8. Ecuación de Schrödinger electrónica……… 15

Ecuación 9 . Desarrollo del operador Hamiltoniano……… 15

Ecuación 10. Determinante de Slater……………………… 16

Ecuación 11. Combinación lineal de orbitales atómicos……… 16

Ecuación 12. Modelo de Descarte Modificado del Solapamiento Diatómico
(MNDO por sus siglas en inglés)………………… 17

Ecuación 13. Modelo Austin Model 1……………………………… 18

Ecuación 14. Ecuación de Randles-Sevcik………………………… 21

Ecuación 15. Relación de la corriente de pico con la concentración, en

sistemas irreversibles o cuasi-reversibles. Voltametría

cíclica…………………………………..………………… 21

ix

Ecuación 16. Relación de la corriente de pico con la concentración

Voltametría de pulso diferencial……………………… 23

Ecuación 17. Significado del término sigma (σ)……………………… 23

Ecuación 18. Ecuación de Cottrell……………………………………… 25

Ecuación 19. Equivalencia entre una celda de capa fina y una semi-

Infinita (modelo teórico-computacional aproximado)… 29

Ecuación 20. Primer despeje realizado a la ecuación de equivalencia… 30

Ecuación 21. Segundo despeje realizado a la ecuación de equivalencia.. 30

Ecuación 22. Tercer despeje realizado a la ecuación de equivalencia … 30

Ecuación 23. Interpretación química del potencial de reducción………… 52

Ecuación 24. Cálculo del ΔG de solvatación………………………………. 53

x

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura 1. Capa difusión Nernst…………………………………… 7

Figura 2. Representación esquemática de los distintos fenómenos de

Transporte de masa, en la celda electroquímica…………… 8

Figura 3. Complejos tetrarrutenados estudiados por Mayer y col……… 11

Figura 4. Voltagrama cíclico de una solución 2mM de H 2 (3-TRPyP) en DMF

y en acetonitrilo.......................................................................... 12

Figura 5. Estructuras de la primaquina (PQ), succinilprimaquina (SPQ) y

maleilprimaquina (MPQ) , estudiadas por Mauro A. La-Scalea y col... 13

Figura 6. Señal de excitación para la voltametría cíclica………………………. 19

Figura 7. Parámetros derivados del voltagrama cíclico …………………… 20

Figura 8. Voltagrama cíclico reversible……………………………………..…... 20

Figura 9. Voltagrama cíclico irreversible, y voltagrama cíclico cuasi-reversible....22

Figura 10. Voltametría pulso diferencial………………………………..… 23

Figura 11. Cronoamperometría………………..…………………………… 25

Figura 12. Señal excitación técnica línea de base de potencial único ...….. 26

Figura 13. Celda semi-infinita……………………………………………………….. 27

Figura 14. Celda capa fina…………………………………………………………… 27

Figura 15. Distintos diseños comerciales de celdas electroquímicas de

capa fina………………………………………..………………………… 31

Figura 16. Celda electroquímica de capa fina comercial del tipo Wall-Jet….. 32

Figura 17. Celdas electroquímicas de capa fina comerciales cilíndricas………. 32

xi

Figura 18. Prototipos de celdas electroquímicas de capa fina no comerciales
de fabricación propia………………………………………………… 33
Figura 19. Diseño del detector amperométrico probado por Samcová y col… 34
Figura 20. Planta de la podófila………………………………………………… 39
Figura 21. Molécula de la podofilotoxina……………………………………… 40

Figura 22. Molécula de 4´-desmetilpodofilotoxina……………………………… 41

Figura 23. Mecanismo de reacción propuesto para la 4´-desmetilpodofilo-
toxina……………………………………………………………………. 42
Figura 24. Molécula de etopósido………………………………………………… 43
Figura 25. Molécula de tenipósido ………………………………………………… 43
Figura 26. Voltagramas cíclicos sol. 0.15mM teniposido en electrodo carbón

vítreo a pH 3,7…………………………………………………………. 43

Figura 27. Ciclo termodinámico para la reducción en solución………………… 52

Figura 28. Orbital HOMO y LUMO 1,2-dimetoxibenceno……………………… 58
Figura 29. Orbital HOMO y LUMO1,3-dimetoxibenceno………………………. 59
Figura 30. Orbital HOMO y LUMO 1,4-dimetoxibenceno………………………… 59
Figura 31. 4´-desmetilpodofilotoxina……………………………….......... 63

Figura 32.Podofilotoxina……………………………………....………….. 65

Figura 33. Variación absorbancia máxima vs. % de acetona ………… 67

Figura 34. Voltametría cíclica (VC) de la solución 10mM de podofilotoxina.

Celda semi-infinita estanco. ER: Ag/AgCl……………………… 68

Figura 35. Superficie del electrodo de trabajo luego de la voltametría……… 69

Figura 36. Superficie del contraelectrodo luego de la voltametría…………… 69


xii

Celda semi-infinita estanco. ER: Pt…………..…………… 70


Celda semi-infinita dinámico. ER: Pt…………………………. 70

Figura 39. Voltametría de pulso diferencial (VPD) de la solución 10mM

de podofilotoxina. Celda semi-infinita estanco. ER: Pt……… 71


Celda capa fina estanco. ER: Pt………………………….……. 72


Celda capa fina dinámico. ER: Pt……………………………… 72

Figura 42. Prototipo inicial de celda en plexiglás………………………… 74
Figura 43. Celda construida en acero inoxidable………………………… 74
Figura 44. Interior de la celda construida en acero, con los separadores

de nylon……………………………………………………..…… 75

Figura 45. Celda electroquímica de capa fina con las dimensiones del

cuerpo de la celda…………..……………………..…………… 76

Figura 46. Esquema experimental general seguido para los experimentos

de caracterización………………………………………………… 78

Figura 47. Voltametría cíclica (VC) de la solución 50mM de ferrocianuro de

potasio. Celda semi-infinita estanco. ER: Pt. Varias velocidades de barrido . 80


potasio. Celda capa fina dinámico. ER: Pt. Varias velocidades de barrido.. 80

xiii

Figura 49. Voltametría cíclica (VC) de la solución 50mM de ferrocianuro

de potasio. Celda capa fina estanco. ER: Pt. Varias velocidades de barrido… 82

Figura 50. Voltametría cíclica (VC) de la solución 50mM de ferrocianuro

de potasio. Celda capa fina dinámico. ER: Pt. Varias velocidades de barrido… 82

Figura 51. Desplazamientos observados en el potencial de media onda

y corriente pico anódica entre ambas celdas. Cupla Fe(II)/Fe(III).. 83


potasio. Celda capa fina dinámico. ER: Pt. Varias velocidades de bombeo.. 84

Figura 53. Corriente límite anódica y potencial de media onda vs velocidad

de bombeo a 2mV/seg. Cupla Fe(II)/Fe(III) ……………………… 85

Figura 54. Solución sulfato de cobre 5mM. Acondicionamiento del Vycor.

Diez minutos entre cada voltagrama …………………………….. 86

Figura 55. Voltametrías cíclicas solución sulfato de cobre 5mM. Celda semi-

infinita estanco. Varias velocidades de barrido……… ..………… 87

Figura 56. Voltametrías cíclicas solución sulfato de cobre 5mM. Celda semi-

infinita dinámico. Varias velocidades de barrido……… …….…… 88

Figura 57. Voltametrías cíclicas solución sulfato de cobre 5mM. Celda capa

fina estanco. Varias velocidades de barrido………………..……… 89

Figura 58. Voltametrías cíclicas solución sulfato de cobre 5mM. Celda capa

fina dinámico ………………………..……………………………. 89

Figura 59. Desplazamientos observados en el potencial de media onda anódica

xiv

y corriente pico anódica entre ambas celdas. Cupla Cu(II)/Cu(0) .... 90

Figura 60. Voltametrías cíclicas solución sulfato de cobre. Celda capa fina

dinámico. Variación de velocidad de bombeo. 100 mV/seg ……… 92

Figura 61. Corriente pico anódica y potencial de media onda anódica vs

velocidad de bombeo. Cupla Cu(II)/Cu(0) ………………………… 92

Figura 62. Voltametrías cíclicas del medio electrolítico de la podofilotoxina.

Limpieza de las superficies electródicasde carbón vitrreo 75mV/seg…. 95

Figura 63. Solución 10 mM de podofilotoxina 10 mM. Celda capa fina

Dinámico. Cronoamperometría en flujo segmentado. ……….. 96

Figura 64. Modelo de flujo laminar en relación a la superficie electródica.

Contacto del frente de solución de podofilotoxina con la

superficie electródica …………………………………………… 96

Figura 65. Modelo de flujo laminar en relación a la superficie electródica.

Salida del frente de solución podofilotoxina ………….……… 97

Figura 66. Solución podofilotoxina 10 mM. Celda capa fina dinámico.

Cronoamperometría con inyección en flujo contínuo. ................ 99

Figura 67. Acoplamiento del detector electroquímico de capa fina a la bomba

isocrática de alta presión………………………………………… 99

Figura 68. Cronoamperometria (TPTB) de Inyecciones sucesivas en flujo

de solución podofilotoxina 10mM. Celda capa fina, acoplada a la

bomba isocrática alta presión, a 1mL/min……………….……… 101

xv

Figura 69. Pulso Potencial (TB) inyección en flujo 10��M solución podofilo-

toxina 10mM. Celda capa fina acoplada a la bomba isocratica

alta presión, a 1mL/min……………………………………… 102

Figura 70. Cromatograma inyección en flujo 10mL Solución podofilotoxina

10mM.Detector UV-Vis comercial acoplado a la bomba isocratica

alta resion, a 1mL/min…………………………………… 102

xvi

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1. Comparación entre distintos tipos de detectores empleados en HPLC….5

Tabla 2. Niveles energéticos de los orbitales HOMO y LUMO del

H 2 (4-TRPyP) y composición (%) respectiva de los mismos …........ .12

Tabla 3. Proporciones acetona : agua empleadas en la preparación de las

soluciones, para el seguimiento espectrofotométrico de la solubilidad

de la podofilotoxina……………………………………………………… 54

Tabla 4. Parámetros experimentales de las voltametrías cíclicas de la

podofilotoxina……………………………..……………………………… 57

Tabla 5. Parámetros experimentales de las voltametrias de pulso diferencial

de la podofilotoxina ………………………………..…………………….. 57

Tabla 6. Valores de la simulación de los isómeros del dimetoxibenceno vs

valores experimentales. Orbital HOMO………………………….… 60

Tabla 7. Valores carga de Mulliken protón màs acìdico. 4´-desmetil-

podofilotoxina ……………………………………………………..……. 62

Tabla 8. Valores de la simulación de la 4´-desmetilpodofilotoxina

desprotonada vs valores experimentales. Orbital HOMO……… 63

Tabla 9. Valores carga de Mulliken protón màs acídico. Podofilotoxina ..… 66

Tabla 10. Valores de la simulación de la podofilotoxina desprotonada vs
valores experimentales. Orbital HOMO…………………………… 66
Tabla 11. Componentes del Detector Electroquímico de Capa Fina de

xvii

Plexiglás y de Acero……………………………………………………. 75

Tabla 12. Áreas de las superficies electródicas empleadas………………..… 76

Tabla 13. Parámetros experimentales para el K 4 Fe(CN) 6 .3H 2 O y el CuSO 4 ….. 78

Tabla 14. Valores de desplazamiento en los potenciales anódicos de

Media onda, observados entre la celda semi-infinita y la celda

de capa fina. Solución de ferrocianuro de potasio………..…………… 83

Tabla 15. Valores de desplazamiento en los potenciales anódicos de

media onda, observados entre la celda semi-infinita y la celda

de capa fina. Solución de sulfato de cobre…………………..…… 91

Tabla 16. Parámetros experimentales para las voltametrias cíclicas del

Medio electrolítico de la podofilotoxina, para fines de limpieza

de las superficies electródicas de carbón vítreo, en la celda

electroquímica de capa fina…………………………………………..… 93

Tabla 17. Parámetros experimentales de las cronoamperometrías de la

podofilotoxina, con inyección en flujo segmentado…………………… 95


podofilotoxina, con inyección en flujo continuo……………….….. 98


podofilotoxina, con inyección en flujo continuo, empleando la

bomba isocrática de alta presión…………………………..…… 100

Tabla 20. Parámetros experimentales de las electrólisis a potencial constante

de la podofilotoxina, con inyección en flujo continuo, empleando la

xviii

bomba isocrática de alta presión……………………………… 100

xix

1.1. INTRODUCCIÓN

Actualmente la detección electroquímica ha adquirido un gran auge en el
ámbito científico, ya que entre sus ventajas esta posee un bajo límite de
detección, diseños relativamente sencillos en cuanto a la instrumentación
involucrada, y ofrece la posibilidad de realizar tanto procedimientos de síntesis,
como determinaciones cuantitativas y/o cualitativas, sin el uso de productos
químicos adicionales que pudieran generar productos colaterales nocivos al
medio ambiente. En términos generales, el detector electroquímico es un
dispositivo en el que fluye una corriente eléctrica, como producto de un proceso
redox que ocurre entre la especie electroactiva contenida en el mismo, y la
superficie electródica de un electrodo de trabajo. Adicionalmente a las celdas
electroquímicas típicas, en las que el volumen de solución es considerable en
comparación con la capa de difusión, se han desarrollado los llamados
detectores electroquímicos de capa fina, los cuales son capaces de operar con
pequeños volúmenes de muestra, y han sido diseñados para realizar análisis
tanto en condiciones estancas (en ausencia de flujo), como en condiciones
dinámicas (en presencia de flujo). Gracias al gran avance tecnológico
alcanzado en la automatización del análisis en flujo, el detector electroquímico
representa una alternativa capaz de ofrecer una gran selectividad y rapidez en
el análisis de grandes cantidades de muestra. Considerando todas estas
ventajas, cabe notar la poca información disponible relacionada con los detalles
de diseño y construcción de estos dispositivos. En este sentido, el presente
trabajo, constituye la continuación de una línea de investigación iniciada en el
año 2005 [1], relacionada con el diseño, fabricación, caracterización y puesta a
prueba de detectores electroquímicos de capa fina, los cuales se pueden
acoplar posteriormente a un cromatógrafo líquido HPLC. Debido a que se
deseaba determinar cualitativamente al analito orgánico podofilotoxina, el cual
es soluble en acetona, se debió fabricar un nuevo detector en acero inoxidable
partiendo de un diseño previo manufacturado en plexiglás. Todo esto se ha
realizado con miras a lograr un mayor entendimiento de los aspectos físicos y
electroquímicos que rigen el funcionamiento de estos dispositivos, así como
encontrar experimentalmente una equivalencia entre el comportamiento
2

electroquímico observado con el empleo del detector de capa fina, y aquel
observado con una celda de tipo semi-infinita.

En el presente trabajo, la celda semi-infinita, es una celda cónica de vidrio de
12mL de capacidad. Por otro lado, una celda electroquímica de capa fina es
aquella cuyo grosor sería comparable al de la capa de difusión de Nernst. Se
trata de una celda electroquímica de capa fina de aproximadamente 0,032mL.

La presente Tesis realiza un aporte en cuanto al conocimiento del
comportamiento electroquímico del analito orgánico seleccionado para el
presente trabajo, a saber, la podofilotoxina, el cual a pesar de tener tanta
importancia a nivel farmacéutico debido a sus grandes capacidades
terapéuticas en el tratamiento de diversas afecciones cancerosas, según la
literatura consultada, existen muy pocos reportes relacionados de alguna
manera con la electroquímica del mismo.

Algunas de las ventajas inherentes a los detectores electroquímicos de capa
fina [2],[3] radican en sus bajos límites de detección (en el orden de 1*10-9 M), y
en sus cortos tiempos de análisis. En los inicios de los años sesenta los
investigadores Hubbard, Anson, Cristensen y Osteryoung [4], [5] ,[6], realizaron
una serie de experiencias con cronopotenciometría y voltametría de barrido
lineal, sentando las bases de dicha técnica.

En el campo de los detectores electroquímicos para cromatografía líquida se
han propuesto diversas geometrías de celda y arreglos de flujo. Las
características generales de dichos detectores son: una hidrodinámica bien
definida, bajo volumen muerto, alta tasa de transferencia de masa, alto
cociente señal/ruido, diseño robusto y una respuesta electroquímica
reproducible. Los electrodos comúnmente usados son de carbono (pasta de
carbón o carbón vítreo), o también electrodos de platino, oro o mercurio [7] ,
[8], [9]

3

Cabe destacar que el Laboratorio de Electroquímica posee diversos prototipos
de estos detectores (endógenos), fabricados en plexiglás (polimetil metacrilato
o PMMA), y a través de sus investigaciones espera profundizar en su
funcionamiento y avanzar en su miniaturización.

En el marco del presente trabajo se diseña, construye y prueba un detector
electroquímico de capa fina para la determinación de un analito orgánico, la
podofilotoxina, el cual puede acoplarse a una columna de cromatografía
líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés).

La podofilotoxina es una molécula que posee amplias capacidades
anticancerígenas, y ha sido empleada en el tratamiento de condilomas y otras
afecciones cutáneas. Cabe destacar que esta especie es altamente tóxica si se
suministra en dosis ligeramente más altas de las indicadas, y esto justifica el
empleo de la detección electroquímica motivado a sus bajos límites de
detección, y constituye un aporte novedoso en el estudio de esta especie. En
este sentido se estudió la respuesta electroquímica de la podofilotoxina sobre
una superficie electródica de carbón vítreo, detectándose la oxidación de la
misma.

Se emplea una herramienta de simulación computacional llamada ArgusLab,
para realizar una predicción teórica de la electroactividad de la mencionada
especie. Con este fin, se realizan simulaciones de la molécula podofilotoxina
con sus respectivos orbitales para predecir su electroactividad, es decir, su
suceptibilidad de ceder electrones (proceso de oxidación), o para aceptar
electrones (proceso de reducción). Estos resultados son contrastados con el
comportamiento voltamperométrico experimental de dicha molécula.

En el Capítulo I de la presente Tesis, se exponen algunos los conceptos
básicos de la electroquímica, así como una revisión bibliográfica de lo
relacionado a detectores electroquímicos para HPLC semi-infinitos y de capa
fina. En el Capítulo II, se muestra un resumen de la metodología experimental y
4

aspectos afines del procedimiento experimental. En el Capítulo III, se presentan
los detalles del procedimiento experimental , así como la discusión y análisis de
los resultados obtenidos. Seguidamente, el Capítulo IV detalla todos los
aspectos procedimentales y experimentales relacionados con el detector
electroquímico de capa fina presentado en este trabajo. Por último el Capítulo
V contiene las conclusiones y recomendaciones del presente trabajo.

1.2. Marco Teórico

La detección electroquímica acoplada a HPLC constituye, en la actualidad, una
alternativa cuando los detectores UV-Vis carecen de la sensibilidad y la
selectividad apropiada, para un análisis determinado [10] En este sentido, en la
tabla 1 se muestra la comparación entre varios tipos de detectores empleados
para HPLC.

Tabla 1. Comparación entre distintos tipos de detectores empleados en HPLC. [10]

No destructivos/ sensibles a la concentración Destructivos/ sensibles a la masa
UV Fluores. Ind. IR Electroq. Ioniz. Esp. Abs.
Refracc. Llama Masas Atom
Características
Selectivo Si Si No Si Si No Si Si
Capacidad Si Si No Si No Si Si Si
gradiente
Minima concent. 1e-10 1e-11 1e-7 1e-7 1e-11 1e-7 1e-10 1e-10
detectable (g/mL)
Nivel mín. ng ng-pg µg µg ng-pg µg ng ng
detectable

Los detectores electroquímicos de capa fina resultan apropiados para ser
usados en HPLC, por los bajos volúmenes de muestra comúnmente
considerados durante un análisis cromatográfico de este tipo. Ahora bien, para
que cualquier detección electroquímica sea viable, la condición fundamental
que debe cumplir el analito en estudio, es que posea las propiedades eléctricas
adecuadas o que sea electroactivo. Las propiedades eléctricas del analito, se
refieren a su capacidad para transportar una carga eléctrica neta, confiriéndole

5

al medio en que se encuentra algún grado de conductividad eléctrica, mientras
que la electroactividad está relacionada con la suceptibilidad que posee el
mismo para ceder o aceptar electrones en una interfase electrodo-solución, a la
cual se le ha impuesto una diferencia de potencial. De esta manera, la
molécula del analito puede sufrir un proceso redox, generando una corriente
eléctrica en función del potencial aplicado, lo cual constituye la respuesta
electroquímica clásica de corriente vs potencial, y demuestra
experimentalmente la electroactividad de dicho analito. Ya que los procesos
redox sufridos por estos ocurren en la interfase electrodo-solución, es
necesario recordar los distintos fenómenos de transporte de masa, los cuales
son a saber: convección (generado por un gradiente de presión o temperatura),
migración (generado por un gradiente de campo) y la difusión (generada por un
gradiente de concentración). Para los casos de los sistemas donde la
contribución mayoritaria al transporte de masa es la difusión, las leyes de Fick
explican mediante modelos matemáticos, el cambio en el perfil de
concentración tanto en función a la distancia desde el seno de la solución hasta
la superficie electródica, como en función del tiempo.[11]

Si bien la determinación de la electroactividad se realiza típicamente por vía
experimental (ej. aplicación de voltametría cíclica), ya desde inicios de los años
90, según la literatura consultada [21] , se desarrolló software de simulación
computacional para realizar predicciones del comportamiento electroquímico de
determinadas especies, ofreciendo así una vía alternativa para la predicción de
la electroactividad de una especie dada. En el presente trabajo, se emplea un
software gratuito de simulación molecular para realizar predicciones de la
electroactividad del analito orgánico en estudio (podofilotoxina), previo a la
realización de los análisis experimentales. El software se vale de una serie de
modelos matemáticos derivados de la Ecuación de Shrödinger para realizar los
cálculos respectivos.

Actualmente, a pesar de que existe una diversidad de casas comerciales que
ofrecen una serie de diseños de detectores electroquímicos de capa fina como
Metrohm, Varian, entre otras, y a pesar del gran auge de este tipo de detección

6

en el ámbito científico, sigue siendo muy escasa la información relacionada con
los detalles de dichos diseños, así como lo relacionado con la equivalencia
entre el comportamiento electroquímico de un detector de capa fina, y una
celda electroquímica típica semi-infinita. [2] [3] Debemos recordar que se define
a una celda como semi-infinita cuando su volumen hace despreciable al grosor
de la capa de difusión de Nernst, la cual oscila entre 0,01 y 0,001 mm,
respectivamente en soluciones acuosas sometidas a agitación [12].Esta capa
se define como el gradiente de concentración en la superficie electródica, que
gráficamente se visualiza como la distancia (δ), definida por el intersecto entre
el punto de inflexión del gradiente de concentración, y una recta paralela a la
superficie electródica. (ver figura 1)

Superficie
Solución
Electródica

Figura 1. Capa difusión Nernst

1.2.1. ELECTROQUÍMICA. ALGUNOS CONCEPTOS [13]

En general, podríamos definir a la electroquímica como la rama de la química
encargada de estudiar los procesos de transferencia de carga en la interfase
electrodo-solución. Las especies que sufren estos procesos redox en la
superficie electródica son llamadas electroactivas, y los fenómenos que dan
origen al desplazamiento de la(s) especie(s) electroactiva(s), desde el seno de
la solución hasta la superficie electródica, son llamados fenómenos de
trasporte de masa.

Este transporte puede deberse a un gradiente de concentración (transporte por
difusión), un gradiente de temperatura/presión (transporte por convección), o
por un gradiente de campo (transporte por migración). La figura 2 esquematiza
estos fenómenos:

7

Figura 2. Representación esquemática de los distintos fenómenos de transporte de masa, en la celda
electroquímica. La línea vertical azul denota la superficie electródica. La línea roja punteada denota la
presencia de una membrana.

Cuando la difusión es el fenómeno predominante de transporte de masa, las
Leyes de Fick [11] constituyen un modelo matemático que explica la variación
de la concentración del analito de interés, desde el seno de la solución hasta la
superficie electródica, en relación a la distancia al electrodo (primera ley), y en
relación al tiempo (segunda ley). Ver ecuaciones 1 y 2 respectivamente.

�� = −
��(��)
��
ec.1

=
��(��,��) �� (��,��)
��
ec. 2

Donde:

D: coeficiente de difusión de la especie

dc(x)
dx
: variación de la concentración del analito en relación a la distancia desde

el seno de la solución hasta la superficie electródica

�� 2 ��(��,��)
�� 2
: variación de la concentración del analito en relación al tiempo

8

Cuando se estudia un sistema que posee tanto convección como difusión [14]
(un sistema hidrodinámico) el flujo está dado por la primera ley de Fick
modificada. (Ecuación 3).

�
J = �� − �� ec. 3.

Donde

J: Flujo

c: concentración

ν: velocidad

D: coeficiente de difusión

∇c: perfil de concentración

La expresión correspondiente a la segunda Ley de Fick en este caso es,
(ecuación 4) [14] :

��
� �
= �� 2 �� − ��
��
ec. 4

La utilidad de las ecuaciones 3 y 4 estriba en que proporcionan un análisis
matemático del transporte de masa en condiciones conveccionales, lo cual
podría ser de interés, para el estudio de algunos de los experimentos
planteados en la presente Tesis. Al expresar esta ecuación en coordenadas
cartesianas se obtiene tanto el componente difusional (ecuación 5 parte A)
como el componente conveccional (ecuación 5 parte B)

= �� ( ��2 + + ) − ( �� + �� + �� )
�� 2 �� 2 �� 2 ��
�� 2 �� 2 ��
ec. 5

A B

9

Donde ν denota el componente de velocidad del fluido en la coordenada
correspondiente (X,Y o Z). De esta manera, la solución de la ecuación 4 se
deriva del análisis del perfil de velocidad, derivada a su vez de la ecuación de
la continuidad del momento, y de la ley de la conservación del momento.

Dicho perfil depende de la naturaleza del flujo, el cual puede ser laminar, de
transición o turbulento. La mayoría de las investigaciones electroquímicas se
realizan bajo régimen laminar. Una consideración importante en estos cálculos,
es que en la capa de difusión no hay convección. Esto conlleva a que las
variaciones en los componentes espaciales de la velocidad, deben ocurrir a
distancias mayores que la capa de difusión, al menos en un factor de 10.

1.2.2. VÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ELECTROACTIVIDAD

La electroactividad de determinada sustancia se puede verificar, mediante el
uso de herramientas de simulación molecular computacionales, o bien
mediante la aplicación de técnicas electroquímicas. A continuación se reseñan
los modelos de cálculo comúnmente empleados por los programas
computacionales de simulación molecular:

I. MODELAJE MOLECULAR

Como habíamos señalado anteriormente, se desea implementar la simulación
molecular computacional, como herramienta de predicción de la
electroactividad del analito orgánico podofilotoxina. A fin de respaldar el empleo
de dicha herramienta, se citarán dos referencias que evidencian el grado de
concordancia logrado entre las estimaciones teórico-computacionales, y la
repuesta experimental de los sistemas en cuestión.

1. En estudios realizados por Mayer y col [15], se analizaron las
propiedades espectroscópicas y electroquímicas de dos isómeros de la
especie supramolecular [μ-(H 2 TPyP){Ru-(bpy) 2 Cl} 4 ]4+ las cuales fueron
comparadas y consistentemente interpretadas con la ayuda de cálculos
de orbital molecular. En estos complejos (ver figura 3), los niveles
HOMO y LUMO están mayormente localizados en los átomos de rutenio

10

y el anillo porfirínico, respectivamente. Existe una gran combinación de
las funciones de onda de ambos componentes en otros orbitales
moleculares y sus contribuciones se reflejan en su comportamiento
espectroelectroquímico y espectroscópico.

Figura 3. Complejos tetrarrutenados estudiados por Mayer y col.

Los orbitales HOMO y LUMO más relevantes fueron simulados mediante
cálculos SCF (Self-Consistent Field/Método del Campo Autoconsistente).
El orbital HOMO (MO373) de la especie H 2 (4-TRPyP) esta mayormente
localizado en los complejos rutenio polipiridilos (66%), pero posee una
contribución substancial de la estructura porfirínica(24%), donde la
densidad electrónica se concentra sobre el nitrógeno pirrolico y los
carbonos meso. Los dos orbitales LUMO más bajos (MO374 y 375)
están mayormente localizados sobre el anillo porfirínico. En la tabla 2 se
pueden observar los valores de los niveles energéticos de los orbitales
HOMO y LUMO del H 2 (4-TRPyP), así como la respectiva composición
porcentual de los mismos, determinados mediante el cálculo con el
método del campo auto-consistente.

11

Tabla 2. Niveles energéticos de los orbitales HOMO y LUMO del H 2 (4-TRPyP) y composición
(%) respectiva de los mismos.

Nº Orbital Energía % Orb. Ru % Orb. Cl % Orb. % Orb. % Orb.
(eV) Piridilo Porfirina Bipiridil
375 -7.94 0.43 0.01 6.93 92.07 0.57
LUMO 374 -7.95 0.66 0.01 10.99 87.32 1.02
HOMO 373 -12.25 46.54 1.61 10.32 23.59 17.94

El orbital HOMO (MO373) del isómero meta esta mayormente localizado (89%)
sobre los complejos periféricos de rutenio, incluyendo los grupos piridilo puente
(9%), mientras que la contribución del anillo porfirínico es muy pequeña (<2%).
Por otra parte, los dos orbitales LUMO de menor energía (MO374 y 375) están
esencialmente localizados sobre el anillo porfirínico (91%) y sobre el grupo
piridilo puente (9%), en analogía con el isómero para.

En cuanto a la electroquímica del H 2 (3-TRPyP), ésta fue estudiada mediante
voltametría cíclica, tal como se observa en la figura 4, en medio de
dimetilformamida (DMF) y acetonitrilo.

Figura 4. Voltagrama cíclico de una solución 2mM de H 2 (3-TRPyP) en DMF y en
acetonitrilo.

12

Los cálculos de modelaje molecular mostraron que los orbitales HOMO y
LUMO de las porfirinas tetrarrutenadas se localizan mayormente en los
complejos de rutenio y el anillo porfirínico, respectivamente. Sin embargo,
existen orbitales con un alto grado de combinación especialmente en el
isómero para. Lo más relevante fue que se observó una buena consistencia
entre los resultados teóricos y los electroquímicos, respaldando la asignación e
interpretación de los procesos redox observados en las porfirinas
supramoleculares.

2. Mauro A. La-Scalea y colaboradores, [16] empleando el método semi-
empírico AM1 del programa Spartan 04 para Linux (v. 119 Wavefunction
Inc), encontraron que la densidad electrónica del anillo quinólico no
protonado de la primaquina, es mayor que la de la especie protonada o
diprotonada. Estos análisis fueron complementados mediante
voltametría cíclica con electrodo de carbón vítreo. En la figura 5 se
muestran las estructuras de los compuestos estudiados.

Figura 5. Estructuras de la primaquina (PQ), succinilprimaquina (SPQ) y
maleilprimaquina (MPQ) , estudiadas por Mauro A. La-Scalea y col.

13

Para realizar el modelaje molecular, se empleó el modelo AM1 bajo
condiciones ácidas, neutras y básicas, y se obtuvo lo siguiente:

• La forma protonada de los átomos de nitrógeno en la cadena lateral,
N(19), y en el anillo quinólico.
• Activación de la primaquina, a través del enlace a la amida.
• El método AM1 puede considerarse apto para reproducir la data
experimental de la estructura considerando su estado de mínima
energía.

Adicionalmente, la energía del orbital HOMO también fue calculada. El
incremento de los autovalores HOMO era simultáneo al proceso de
deprotonación como consecuencia del aumento del pH. Se obtuvieron
autovalores aproximados para la primaquina (PQ), la succinilprimaquina
(SPQ) y la maleilprimaquina (MPQ) de acuerdo con las pequeñas
diferencias en los valores de potencial de pico anódico. Es importante notar
que en medio ácido, el SPQH+ y el MPQH+ tenían mayor carácter oxidativo
que el PQH 2 2+, lo cual se confirmó mediante los autovalores HOMO.

El orbital HOMO está relacionado con la capacidad electro-dadora de una
sustancia, lo cual se correlaciona con el potencial redox.

• MODELO HARTREE-FOCK RESTRINGIDO (RHF POR SUS SIGLAS
EN INGLÉS) [17]

A pesar de la gran utilidad de la ecuación de Schrodinger en el
entendimiento de la naturaleza mecánico-cuántica de la materia, es de
hacer notar que esta genera ecuaciones que son prácticamente irresolubles
cuando se trata de sistemas multielectrónicos. Teniendo esto en
consideración, se deben realizar tres aproximaciones a la ecuación de
Schrödinger (ecuación 6)

�
�� Ψ = E Ψ ec. 6.

14

Donde E es la energía del sistema y Ψ es la función de onda de n-
electrones, que depende de la naturaleza y la ubicación de los núcleos y del
número total de electrones. El operador Hamiltoniano se divide en el
componente de energía cinética y de energía potencial de cada partícula
(ecuación 7)

�
�� = −
ℎ2
�
∑ ��2 − ∑
ℎ 1
�2
�� − 4�� ∑ ∑ �� + 4�� ∑ ∑ �� + 4�� ∑ ∑ ��
�� 1 ��
2 2 2 2

2�� 2 �� 0 �� 0 �̈
�� 0 ��

ec. 7.

Donde Z es la carga nuclear, M A es la masa del núcleo A, m c es la masa
del electrón, R AB es la distancia entre los núcleos A y B, r ij es la distancia
entre los electrones i y j , r iA es la distancia entre el electrón i y el núcleo A y
ε 0 es la permitividad del vacío. La primera aproximación realizada a la
Ecuación de Schrodinger considera que los núcleos se mueven con mucha
más lentitud que los electrones, y a esto se denomina aproximación de
Born-Oppenheimer. Esto genera un término de energía cinética nuclear en
la ecuación anterior, el segundo término, que es cero y un término de
energía coulombiana núcleo-núcleo, el último término que es constante. Lo
que resulta es la ecuación de Schrodinger electrónica (ecuación 8) y el
desarrollo del operador hamiltoniano se muestra en la ecuación 9.

�
�� Ψ�� = �� Ψ�� ec. 8.

�
�� = −
��
� ��
∑ �� −
��
∑∑
��
+ �� ∑ ∑ ��
��
��
ec. 9.

Para calcular la energía total del sistema se requiere sumar a Eel la energía
coulombiana núcleo-núcleo, que es el último término de la ecuación 7.

15

Dado que estas ecuaciones son irresolubles por lo general, para sistemas
multielectrónicos, se debe realizar una segunda aproximación que
considera que los electrones se mueven independientemente unos de otros,
la cual es llamada aproximación de Hartree-Fock. A nivel práctico, los
electrones individuales están confinados en funciones llamadas
espinorbitales X j. Cada uno de los N electrones del sistema “siente” el efecto
de un campo medio debido al resto de los electrones, y para garantizar que
la función de onda polielectrónica Ψ sea asimétrica, se escribe en forma de
una matriz, llamada determinante de Slater (ecuación

��1 (1) ��1 (1) … �� (1)
Ψ= � ��1 (2) ��2…(2) … �� (2) �
1
√��! … … …
��1 (��) ��2 (��) … �� (��)
ec. 10.

Las funciones espinorbital, son el producto entre un componente espacial

y un componente de espín (giro del electrón).

Los orbitales moleculares correspondientes al estado de más baja
energía, se pueden obtener mediante un procedimiento de cálculos
iterativos llamados procedimiento del campo autoconsistente, en el que, a
medida que se realiza un mayor número de cálculos, el valor obtenido se
aproxima aún más a los valores experimentales.

En un intento por simplificar aún más los resultados obtenidos mediante
Hartree-Fock (las cuales son ecuaciones diferenciales), se puede incluir
una tercera aproximación para transformar estos resultados en
ecuaciones algebraicas. Para realizar esta transformación, los orbitales
moleculares se expresan como combinaciones lineales de una serie de
funciones predefinidas conocidas como funciones de base ϕ, bajo la forma
de la combinación lineal de orbitales atómicos (ecuación 11)

�� = ∑ �� ec. 11.

16

Donde c μi que son las incógnitas, son los coeficientes de los orbitales
moleculares. Debido que se considera que las funciones ϕ están ubicadas
en posiciones nucleares, se denominan orbitales atómicos, y la ecuación 11
se le llama combinación lineal de orbitales atómicos.

• MODELO DE DESCARTE MODIFICADO DEL SOLAPAMIENTO
DIATÓMICO (MNDO POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) [18]

Debido a una serie de errores sistemáticos que se cometían en los
resultados calculados a partir del modelo anterior, se debió reformular el
mismo, dando lugar al modelo MNDO que se muestra a continuación.

La repulsión núcleo-núcleo de este modelo, tiene la forma (ecuación 12)

��
�� = (��, ��) = ��´�� ´�� 〈�� 〉 (1 + �� −�� + �� −�� ) ec. 12.

Algunas limitaciones de este modelo son:

A. Predice que los hidrocarburos ramificados y con impedimento estérico
son muy inestables, en relación a sus análogos de cadena abierta.

B. Los anillos de cuatro miembros son muy estables.

C. Las interacciones débiles no son posibles. Por ejemplo, el MNDO no
predice los enlaces a hidrógeno.

D. Las energías de activación para la formación o rompimiento de
enlaces son muy altas.

E. Las estructuras no-clásicas se predicen como inestables, en relación
a las estructuras clásicas (e.g etil radical)

F. Las afinidades hacia los protones son predichas con deficiencia.

G. Los sustituyentes oxigenados de los anillos aromáticos están fuera
del plano (e.g. nitrobenceno)

17

H. Los enlaces de los peróxidos son muy cortos (aproximadamente
0.17Å menores)

I. El ángulo C-X-C en los éteres y los sulfuros es muy grande
(aproximadamente 9º mayor)

• MODELO AUSTIN MODEL 1 (AM1) [18]

Luego del empleo del modelo MNDO, se hizo claro que este generaba
errores sistemáticos, debidos a la repulsión interatómica entre aquellos
átomos que se hallaban a 2 o 3 Å de distancia. A fin de solventar esta
situación, se modificó la función núcleo-núcleo, por la adición de funciones
Gausianas, y todo el modelo fue reformulado, resultando el modelo AM1
(Austin Model 1). La repulsión núcleo-núcleo del AM1 tiene la forma

��´�� ´��
(ecuación 13)
�� 1 (��, ��) = �� (��, ��) + �(�� −�� (�� −��) + (�� −��(�� −��) ) ��. 13
��
2 2
��

El programa de simulación molecular ArgusLab, empleado en el presente
trabajo, emplea los modelos del Campo AutoConsistente (Hartree-Fock), y el
modelo AM1.

II. TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS [13]

A. VOLTAMETRÍA CÍCLICA (VC): Esta técnica consiste en la aplicación de un
potencial que varía linealmente en el tiempo a partir de un potencial E1 hasta
un potencial E2, donde el barrido se revierte hasta alcanzar nuevamente a E1.
En la figura 6, se muestra la señal de excitación de esta técnica.

18

Figura 6. Señal de excitación para la voltametría cíclica

La voltametría cíclica provee una serie de datos sobre el sistema en estudio, y
es ampliamente utilizada como herramienta preliminar para la comprensión del
carácter electroquímico del mismo. Así, se pueden analizar las especies
formadas por oxidación en el barrido de potencial desde E1 hasta E2 y la
reducción de las mismas durante el barrido entre E2 y E1. Adicionalmente se
puede determinar fácilmente el nivel de limpieza del electrodo de trabajo y la
superficie real del mismo que participa de la reacción electroquímica. También
se puede investigar la reversibilidad del proceso y la estabilidad de los distintos
estados de oxidación en los que pudiera existir el analito.

Los parámetros cuantitativos del voltagrama cíclico son: las corrientes de pico
anódico y catódico (Ipa, Ipc), los potenciales donde aparecen dichos picos (Epa
y Epc respectivamente), el potencial donde la corriente es la mitad de la
corriente de pico (Ep/2), la diferencia de potencial entre el pico de corriente
anódico y catódico (ΔEp). Las zonas de control cinético (Zc), control mixto (Zm)
y control difusional (Zd), no son parámetros cuantitativos pero proporcionan
información sobre el comportamiento de la especie en estudio. Todos estos
parámetros se pueden apreciar en el siguiente voltagrama (figura 7)

19

Figura 7. Parámetros derivados del voltagrama cíclico [13]

La figura 8 ilustra la respuesta de una cupla reversible durante un solo ciclo,
con la salvedad de que en dicha figura, los potenciales catódicos y anódicos se
encuentran en posiciones opuestas al del voltagrama de la figura 7. Se asume
que inicialmente sólo se tiene especie oxidada (O). De esta manera, se realiza
un barrido hacia potenciales negativos para el primer medio-ciclo. A medida
que el potencial aplicado se aproxima al valor característico de E0 del proceso
redox, la corriente catódica comienza a incrementar, hasta alcanzar un pico.
Luego de pasar la región de potencial en la que ocurre la reducción, se revierte
la dirección del barrido de potencial. Durante el barrido reverso, las moléculas
R (del proceso anterior) son oxidadas una vez más.

Barrido Directo

Barrido Inverso

Figura 8. Voltagrama cíclico reversible

En la figura anterior, la corriente por encima del eje de potencial es catódica, y
por debajo es anódica.

20

En el caso de sistemas reversibles bajo control difusional, la ecuación que
relaciona la corriente de pico (I p ) con la concentración del analito en estudio, es
la de Randles-Sevcik (ecuación 14)

�� = (2.69 ∗ 105 )��3/2 ��1/2 �� 1/2 ec. 14.

Donde:

(i p ) es la corriente de pico

(n) es el número de electrones

(A) es el área electródica en cm2

(C) es la concentración en mM

(D) es el coeficiente de difusión en cm2/seg

(ν) es la velocidad de barrido en V/seg

En el caso de sistemas irreversibles o cuasi-reversibles, la relación de
las corrientes con la concentración es (ecuación 15)

�� = (2.99 ∗ 105 )��(�� )2 ��2 �� 2
1 1 1
ec. 15

Donde:

(α) es el coeficiente de transferencia de carga

(n α ) es el número de electrones involucrados en el paso de transferencia
de carga.

En la figura 9 se puede apreciar la comparación entre un voltagrama
cíclico irreversible (A) y otro cuasi-reversible (B)

21

Figura 9. Voltagrama cíclico irreversible (curva A), y voltagrama cíclico cuasi-reversible (curva B)

Basados en los modelos matemáticos que establece la técnica de la
voltametría cíclica, así como mediante el análisis de su respuesta instrumental,
se puede recabar información sobre el comportamiento electroquímico del
sistema en estudio (criterios de reversibilidad, cuantificación del analito)

22

B. VOLTAMETRÍA DE PULSO DIFERENCIAL (VPD): Esta técnica es
parecida a la anterior pero la señal de excitación consiste en un tren de pulsos
de forma escalonada en el que el potencial de base se incrementa entre cada
pulso (figura 10).

Figura 10A: Señal
de excitación VPD

Figura 10B: Respuesta instrumental
VPD

Figura 10.Voltametría Pulso Diferencial

La corriente se mide dos veces, justo antes del inicio del pulso y antes de su
finalización, al decaer la corriente de carga. La primera corriente se resta de la
segunda de manera instrumental, y el resultado se grafica en contra del
potencial aplicado. El voltamperograma resultante muestra picos de corriente,
cuyas alturas son directamente proporcionales a la concentración de los
analitos (ecuación 16) en la cual el término sigma (σ) viene dado por la
ecuación 17.

�� = �1+��
�� 1/2 �� 1−��
��
ec. 16

�� = ��[(nF/RT)(∆��/2)] ec. 17

Donde (ΔE) es la amplitud del pulso.
23

Esta técnica permite lograr una mayor definición en la señal instrumental, ya
que debido al empleo del tren de pulsos, y a la resta de los valores de corriente
justo antes del inicio del pulso y de su finalización, se eliminan las
contribuciones no faradaicas.

CRONOAMPEROMETRÍA

C. LÍNEA BASE DE TRIPLE PULSO (TPTB) (MODALIDAD DE
CRONOAMPEROMETRÍA CON TREN DE POTENCIALES): La aplicación de
un pulso de potencial por un determinado tiempo es la forma más simple de
producir y aplicar una señal de excitación al electrodo de trabajo. El pulso de
potencial aplicado (ver figura 11) en la cronoamperometría posee las siguientes
características:

• Aplicación de un potencial inicial (E 1 ) al electrodo de trabajo, donde
no ocurre ningún proceso faradaico.
• Cambio rápido de E 1 a otro potencial llamado potencial de pulso (E p ),
donde se produce un proceso de oxidación o reducción en la superficie
del electrodo de trabajo (proceso faradaico) durante un período muy
corto (t).
• Cambio del potencial E p a otro valor de potencial denominado
potencial final (E f ) en el cual no ocurre ningún proceso faradáico.

24

En la figura 11 se muestra la respuesta instrumental obtenida con esta
técnica (aplicación de un solo pulso). Los números romanos en la figura
11A, muestran los tres pulsos considerados en la técnica de TPTB.

II
III
I

Figura 11A. Señal Excitación Figura 11B. Respuesta instrumental

Figura 11. Cronoamperometría

En la cronoamperometría (empleando un electrodo plano) la corriente
decae con el tiempo según la ecuación de Cottrell (ecuación 18)

��(��) =
nFAC��1/2
= k�� −1/2
�� 1/2 �� 1/2
ec. 18.

En el presente trabajo se empleará la técnica de línea base de triple pulso, la
cual es una modalidad de la cronoamperometría que permite la aplicación de
un mayor número de pulsos durante el experimento.

D. LÍNEA DE BASE DE POTENCIAL ÚNICO (TB) (MODALIDAD DE
CRONOAMPEROMETRÍA CON POTENCIAL FIJO):

La señal de excitación para esta técnica, consiste en la aplicación de un
potencial constante al electrodo de trabajo. Con esta técnica se posibilita el
muestreo de la corriente resultante, durante la aplicación de un potencial fijo en
el cual ocurre el proceso redox de interés.

25

Figura 12. Señal excitación técnica línea de base de potencial único

1.2.3. GENERALIDADES DE LA CELDA ELECTROQUÍMICA [13]
La celda electroquímica es un dispositivo que puede convertir la energía
química en energía eléctrica o viceversa, cuando ocurre un proceso redox.
Normalmente, la celda se constituye de dos o tres electrodos sumergidos en
una solución electrolítica donde, en la correspondiente interfase electrodo-
solución, ocurre un proceso redox. Estas celdas se clasifican en dos grandes
grupos a saber: celda galvánica y celda electrolítica.

La celda galvánica es aquella que convierte la energía química en eléctrica, en
ella, la diferencia de potencial se genera como consecuencia de la formación
de una interfase con características termodinámicas y cinéticas tales que se
produce una reacción redox espontánea.

En las celdas electrolíticas, se debe imponer una diferencia de potencial a los
electrodos, los cuales están conectados a través de un circuito externo, para
provocar el intercambio electrónico en la intefase electrodo-solución.

La celda electrolítica convierte energía eléctrica en energía química. El empleo
de estos dispositivos se hace necesario cuando no se produce ninguna
reacción electroquímica en la interfase electrodo-solución y, por tanto, se debe
aplicar una corriente eléctrica al sistema, para inducirla.

26

En términos generales, el diseño de las celdas electroquímicas se divide en
dos grandes grupos a saber, celdas semi-infinitas (figura 13) y celdas de capa
fina o finitas (figura 14) [19]

Figura 13. Celda semi-infinita Figura 14. Celda capa fina

1.2.4. TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS SEMI-INFINITAS Y
JUSTIFICACIÓN DE LAS CELDAS DE CAPA FINA [7]

Los métodos electroquímicos, son generalmente empleados bajo condiciones
que involucran un cociente pequeño entre el área electródica (A) y el volumen
de solución (V). Esto permite realizar experimentos en períodos de tiempo lo
suficientemente largos, sin cambios apreciables de reactante(s) y producto(s)
en el seno de la solución, y posibilitan el mantenimiento de las condiciones de
borde semi-infinitas durante repetidos ensayos. Sin embargo, existen
circunstancias donde se desea alterar la composición del seno de la solución
de manera considerable mediante electrólisis. Estos métodos de electrólisis
exhaustiva están caracterizados por un gran cociente A/V (esta es la causa
principal que inicialmente da origen a la creación de las celdas electroquímicas
de capa fina) y las condiciones más efectivas de transporte de masa. A pesar
que los métodos de electrólisis exhaustiva están generalmente caracterizados
por grandes corrientes y duraciones de minutos u horas, los principios básicos
que rigen las reacciones electródicas siguen siendo válidos.

27

1.2.5 ANTECEDENTES DE LA ELECTROQUÍMICA EN CAPA FINA
[4], [5], [6], [20], [21], [22]

La técnica de electroquímica en capa fina fue propuesta y desarrollada a
principios de los años 60 por los investigadores A.T Hubbard, Fred Anson,
Charles Christensen y R.A. Osteryoung quienes sentaron las bases teóricas y
matemáticas del funcionamiento de la capa fina, mediante investigaciones
empleando inicialmente cronopotenciometria y luego voltametría de barrido
lineal.

En el estudio de Christensen y Anson [4] se presentó la teoría de la
cronopotenciometría de una especie electroactiva confinada en una capa fina,
siendo el sistema en estudio la reducción de hierro (III) en ácido perclórico. Un
par de años después, Hubbard y Anson emplean la voltametría de barrido lineal
para el sistema Fe(III)/Fe(II) [6] y a partir de estos estudios desarrollaron
muchas de las ecuaciones básicas que se aplican en la electroquímica de capa
fina y su comparación con los sistemas semi-infinitos. Se demostró la gran
simplicidad inherente en la voltametría de barrido en capa fina debido a la
ausencia de transferencia de masa limitada por difusión. La expresión de
corriente de pico en capa fina no contiene al coeficiente de difusión y es válida,
sin alteraciones, para reacciones por paso o reactivos mezclados siempre y
cuando los potenciales estándar de los reactivos difieran en al menos 0,2
voltios (de otra manera los componentes de la corriente son aditivos). Los
experimentos de múltiples barridos en capas finas no involucran
complicaciones adicionales.

En estudios sobre capa fina realizados en la década del 90, se hizo mayor
empleo de simulaciones computacionales para analizar el efecto de la caída
óhmica y el comportamiento de la difusión dentro de la capa fina. Los
investigadores Ting Chen, Shaojun Dong y Yuanwu Xie [20] estudiaron en
detalle la influencia de la resistencia de la capa fina con voltametría cíclica.

28

Dicha resistencia causa una distribución no uniforme de la densidad de
corriente dentro de la celda, lo cual puede considerarse una desventaja, y
puede ser de dos clases a saber:
A. La resistencia sin compensar (r u ), que es la existente entre el
electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, que resulta de la
diferencia de potencial entre estos. El valor de r u varía con la posición
del contacto del electrodo de referencia (capilar Luggin).

B. Resistencia de la solución contenida en la cavidad de la capa fina
(r s ). Dentro de la cavidad, diferentes puntos de la solución cercana al
electrodo de trabajo poseen distintas posiciones en relación al contra-
electrodo y esto causa diversas caídas IR y, por tanto, una distribución
no uniforme de corriente a lo largo de la cavidad.

El efecto resistivo en la electroquímica de capa fina ya ha sido reportado en la
literatura y se han realizado muchos intentos para reducir las caídas IR. En la
celda capa fina ideal, los experimentos con voltametría cíclica arrojarían
valores de diferencia de potenciales de pico (ΔEp) de cero, de tratarse de una
transferencia electrónica reversible. Pero, debido a la influencia de la
polarización óhmica (polarización generada por la resistencia natural del
material que constituye al electrodo, o por la resistencia propia de la solución
en estudio), el efecto de borde (curvatura de las líneas de campo que se
genera en los bordes de la superficie electródica) y la difusión de las especies
electroactivas dentro de la cavidad de la capa fina, el ΔEp no es igual a cero en
muchos casos. Por tanto se debe evaluar la influencia de dicha polarización
sobre el potencial de pico (Ep). En otra publicación de los mismos
investigadores [21] se deduce una importante ecuación (ecuación 19) que
muestra la equivalencia teórico-computacional aproximada entre una celda de
capa fina y una semi-infinita, brindando así una herramienta de gran utilidad
para el diseño de las celdas de capa fina.

= ��, ��( �� )
��∆�� .��
��−��∆��
ec. 19.

29

Donde:

(n) número de electrones

(ΔE p ) diferencia entre potenciales de pico

(F) constante de Faraday

(R) constante de los Gases

(T) temperatura en Grados Kelvin

(ν) velocidad de barrido

(d) grosor celda capa fina

(D) coeficiente de difusión

Considerando que el segundo término de la ecuación 19 es una constante (k),

�� = 59�� − ��
por despeje de términos tenemos:

ec. 20

59�� = �� + ��
y por lo tanto

ec. 21

donde

�� = ��+��
59��
ec. 22

1.2.6. JUSTIFICACIÓN DE LA CELDA ELECTROQUÍMICA DE CAPA
FINA PARA HPLC

Las celdas electroquímicas de capa fina tienen su plena justificación debido a
la necesidad de realizar análisis de pequeños volúmenes de muestra, o bien de
celdas para realizar análisis en condiciones de flujos mínimos (tal como es el
caso de la detección vía HPLC-ED), se justificó hace algunas décadas, la
creación de los detectores electroquímicos de capa fina.

30

1.2.7. CELDAS ELECTROQUÍMICAS DE CAPA FINA COMERCIALES
Y NO COMERCIALES [1]

En cuanto a los detectores electroquímicos más comunes diseñados
especialmente para ser acoplados a las columnas de HPLC tenemos:

A. Celdas de Capa Fina: estas operan mediante el paso paralelo del flujo del
analito a la superficie del electrodo de trabajo. Consisten generalmente, en un
arreglo en el que los electrodos de trabajo y contraelectrodo se hallan
adosados a las paredes de un conducto capilar, en cuya salida se encuentra el
contacto al electrodo de referencia (figura 15) Estos sistemas suelen colocarse
dentro de un bloque de acrílico. Por lo general, este tipo de celdas poseen
bajos límites de detección, amplio rango lineal y buena reproducibilidad en las
mediciones.

Figura 15. Distintos diseños comerciales de celdas electroquímicas de capa fina. ET denota al electrodo
de trabajo, CE denota al contraelectrodo y ER denota al electrodo de referencia. La línea segmentada,
denota la presencia de una membrana.

B. Celdas de Capa Fina Tipo Wall Jet (figura 16): opera con el flujo
perpendicular a la superficie del electrodo de trabajo. Este diseño
aparentemente provee una transferencia de masa más efectiva hacia la
superficie electródica, pero las celdas de capa fina convencionales han dado
mejores resultados.[1]

31

Figura 16. Celda electroquímica de capa fina comercial del tipo Wall-Jet. ET denota al electrodo de
trabajo, CE denota al contraelectrodo y ER denota al electrodo de referencia.

Otro arreglo posible [23] de estos electrodos dentro de la capa fina, consiste en
un canal cilíndrico (figura 17) el cual es atravesado internamente por el
electrodo de trabajo, ubicando al electrodo de referencia y al contraelectrodo
aguas abajo. Otra posibilidad es incrustar un al electrodo de trabajo, de forma
cilíndrica, en las paredes del ducto cilíndrico.

E E
ER, ER,
T T
CE CE

Figura 17. Celdas electroquímicas de capa fina comerciales cilíndricas. ET denota al electrodo de trabajo,
CE denota al contraelectrodo y ER denota al electrodo de referencia.

1.2.8. CELDAS DE CAPA FINA DESARROLLADAS EN EL
LABORATORIO DE ELECTROQUÍMICA-FACULTAD DE CIENCIAS-
ULA.

Debido a una línea de investigación iniciada en el año 2005, relacionada con el
desarrollo de detectores electroquímicos para sistemas de flujo, en el
32

Laboratorio de Electroquímica de la Universidad de Los Andes, se cuenta
actualmente con una serie de prototipos de celda manufacturados en plexiglás
(figura 18) para la realización de determinaciones mediante la técnica acoplada
HPLC-ED.

Figura 18. Prototipos de celdas electroquímicas de capa fina no comerciales de fabricación propia.

1.2.9. TÉCNICA ACOPLADA HPLC-ED [24]

Actualmente existe gran interés por las técnicas analíticas de flujo entre las
cuales se encuentra el análisis en flujo continuo (CFA por sus siglas en inglés),
el análisis por inyección en flujo (FIA por sus siglas en inglés) y la
cromatografía líquida. En el caso de la cromatografía, se han desarrollado
distintos tipos de detectores, los cuales se mencionaran más adelante, pero
uno de los más populares es el detector UV-Vis. Actualmente, el detector
electroquímico constituye una opción cuando los detectores UV-Vis carecen de
la sensibilidad y/o selectividad para un análisis particular. Los detectores
electroquímicos acoplados a sistemas de flujo se dividen en dos grandes
grupos: primero los detectores que se basan en la transferencia de carga entre
la fase que contiene a los analitos y otra fase que es eléctricamente
conductora, o semiconductora, e incluye a la mayoría de las técnicas
potenciométricas, voltamétricas y coulombimétricas, y, segundo, los detectores
basados en la medición de las propiedades eléctricas de líquidos. La gran
ventaja de los detectores pertenecientes al primer grupo es que son selectivos,
mientras que los segundos no lo son.

33

Dos características importantes a considerar en los experimentos de flujo son
la fortaleza mecánica del detector ante dicho flujo, es decir, el material del cual
está hecho el detector no debe deteriorarse ante el paso del flujo a través de él,
así como la morfología del flujo (forma y anchura). Sin embargo, la segunda
característica no es relevante para sistemas de monitoreo continuo, por cuanto
su tiempo de residencia en el sistema analítico no es muy largo.

A continuación se presentan dos artículos que destacan algunas ventajas de la
detección vía HPLC-ED. Cabe destacar que en lo referente a la caracterización
de estos dispositivos, lo cual constituye uno de los pilares del presente trabajo
de Tesis, la literatura disponible es bastante escasa.

1. En la investigación realizada por Samcová y col. [2] se probó un
detector amperométrico (figura 19) simple con un electrodo tubular de
platino en la determinación de 8-hidroxi-2`-deoxiguanosina (8-OHdG)
mediante cromatografía HPLC. El límite de detección para el 8-OHdG
fue de 3nM (relación S/R =3), y fue comparable con el obtenido
mediante el detector amperométrico convencional.

Figura 19. Diseño del detector amperométrico probado por Samcová y col.

La ampliación de la figura 19 muestra el diseño del detector con
electrodo tubular de platino empleado; en ella se pueden observar las
partes constituyentes del detector, a saber: (1) salida de la columna
HPLC, (2) electrodo tubular de Pt, (3,4) electrodo auxiliar y de referencia,
(5) potenciostato, (6) solución electrolítica, (7) salida al desecho.
Ampliacion: (a) tubo de Pt, (b) tubos de teflón, (c) soldadura de estaño
para contacto con el tubo de Pt, (d) tubo sumergible.

34

La cuantificación del 8-OHdG en orina se basó en la medición del alto de
pico amperométrico usando la curva de regresión lineal preparada con
soluciones acuosas preparadas con anterioridad. Los resultados fueron
lineales en el rango de 50 hasta 500nM. En comparación con la
sensibilidad de la determinación electroquímica directa, con un
microelectrodo de Pt (aproximadamente 1nA a 0.5mM), la sensibilidad
del análisis HPLC-ED (aproximadamente 1nA a 100nM) es
aproximadamente 5*103 veces mayor. Esto se debe a la mayor
superficie efectiva del detector tubular de Pt (6*10-3cm2) comparado con
la del microelectrodo (3*10-6cm2). El límite de detección (LDD) fue de
3nM. En conclusión, la técnica HPLC-ED con el detector tubular de Pt
puede ser usado de manera confiable para mediciones indirectas del 8-
OHdG en niveles superiores a 3nM.

2. En la investigación presentada por Xiaoling Yan y col. [3] por primera
vez se empleó HPLC-ED en el análisis del producto natural Brazilein. El
trabajo tuvo por finalidad establecer un método sencillo y preciso para la
determinación de un producto natural (Brazilein) en muestras de plantas,
motivado a sus potencialidades farmacéuticas. El método propuesto es
sencillo, rápido (tiempo de análisis aprox 10min), sensible (límite de
detección: 0.6ng por cada inyección de 20 μL, con una relación S/N 3:1),
altamente selectivo y preciso (precisión diaria e interdiaria alrededor del
5%, n=7). La correspondiente curva de calibración fue lineal en el rango
de 0.6 a 150 ng por cada inyección de 20μL. La recuperación del
Brazilein estuvo por encima del 92% por método de adición de estándar.

La corriente de pico para el Brazilein aumentaba considerablemente a
medida que el potencial se variaba de 400 a 550mV vs el electrodo de
referencia de Ag/AgCl. Para mantener una línea de base estable, una
respuesta de señal constante y el mejor límite de detección, se empleó un
potencial de 450 mV vs Ag/AgCl.

35

En cuanto a las celdas disponibles comercialmente, existen diversas casas
comerciales que venden detectores electroquímicos, como Metrohm y Varian
entre otros, pero cabe destacar que las mismas no proporcionan información
sobre el diseño de dichos dispositivos. Según las fuentes consultadas, se
limitan a mencionar los electrodos empleados y/o recomendados, intervalo de
corriente / potenciales a los cuales han sido empleados, y en algunos casos las
dimensiones del detector como tal. Motivado en parte a esta situación de
control en la difusión de informaciones más detalladas sobre la construcción de
estos dispositivos comerciales, la presente Tesis pretende establecer los
parámetros necesarios para garantizar la correcta manufactura, la
caracterización y la calificación de estos detectores.

1.2.10. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS [10], [25], [26], [27]

Las técnicas cromatográficas en general, se definen como técnicas de
separación de una mezcla de solutos en solución, las cuales se basan en las
diferentes velocidades con que se desplazan cada uno de los componentes de
la mezcla a través de un medio sólido poroso insoluble, inorgánico u orgánico,
finamente repartido. Los componentes de la mezcla son arrastrados por un
solvente en movimiento, a lo largo del empaquetamiento de la columna (fase
estacionaria). La diferencia en las velocidades de tránsito de los distintos
analitos hasta su llegada al detector (donde se registra el cromatograma), tiene
su origen en las distintas fuerzas de retención que en mayor o menor medida,
retardan este tránsito, posibilitando la separación de los componentes. Las
fortalezas de adsorción de estas interacciones tienen el siguiente orden
aproximado:

Formación de sales > Coordinación > Puente de Hidrógeno > Dipolo-Dipolo >
Van der Waals.

Dependiendo de la naturaleza de las fases involucradas, son posibles varios
tipos de cromatografía a saber: sólido-líquido, líquido-líquido y gas-líquido, las
cuales operan bajo el mismo principio teórico, en la que la diferencia en la

36

solubilidad o adsortividad de las sustancias, relativa a dos fases, posibilita su
separación, y dicha separación es optimizada cuando el área superficial de
contacto de la fase estacionaria es maximizada.

El investigador que descubrió la cromatografía, fue el botánico ruso Mikhail
Tswett a principios del siglo XX. Él mismo demostró que se podía separar una
mezcla de varios pigmentos vegetales, haciendo fluir dicha mezcla a través de
una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las
especies separadas aparecían como bandas coloreadas en la columna, lo que
justifica el nombre “cromatografía” que proviene del griego chroma que significa
color y graphein que significa escribir. Entre las diversas técnicas
cromatográficas tenemos:

Cromatografía en plano, cromatografía en columna, cromatografía de gases,
cromatografía de fluidos supercríticos, y la cromatografía líquida de alta
presión; siendo esta última la que aquí desarrollaremos en mayor extensión.

• CROMATOGRAFÍA EN PLANO

Estas técnicas incluyen a la cromatografía de capa fina (CCF), la
cromatografía en papel y la electrocromatografía. En todas ellas se emplea una
capa plana y delgada de un material que es el soporte, o que recubre una
superficie plana de vidrio, de plástico o de metal. La fase móvil se desplaza a
través de la fase estacionaria por capilaridad (CCF), por la fuerza de gravedad
(cromat. sobre papel) o por la aplicación de un potencial eléctrico
(electrocromatografía).

• CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

En esta técnica la fase estacionaria está contenida en una columna colocada
de forma vertical, y es alimentada con el eluente o fase móvil por la parte
superior, de tal forma que el eluente avanza a lo largo de la columna gracias a
la fuerza de gravedad. En algunos casos se aplica presión para aumentar la
velocidad de avance del eluente. La muestra se coloca en la parte superior o
37

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