Construccion de una biblioteca genomica

1. Bibliotecas Genómicas
Domínguez Hernández Mariana
Garza Jesús Erick Alejandro
Romero Cruz Víctor Adolfo
Rojas Estrada Anahí

2. Introducción
Hay diferentes tipos de bibliotecas de
Fragmentos en los cuales hay :
Biblioteca de clonos
Biblioteca de DNA
complementario
Biblioteca Restringida
Biblioteca Genómica

3. Bibliotecas Genómicas
• Colección de fragmentos de DNA que
representan tanto todas las secuencias de
un genoma los cuales son clonados en un
vector que puede ser usado o mantenido
establemente.

4. Aplicaciones Para una Biblioteca
Genómica
Secuenciar un gen entero o una región de
un cromosoma
Secuenciación de genomas
 Identificar promotores
 http://www.qb.fcen.uba.ar/bm/2009%20%28ir%20a%20materias.qb.fcen.uba.ar%29/TE%D3RICO
-PR%C1CTICO/Clase%204/Clase%20biblio%20genomica%202009.pdf

5. Construcción de Una biblioteca
Genómica
Corte mecánico o
DNA Genómico
Endonucleasas
Separación por Elección del vector
Tamaño
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/bibliotecas.html

6. Genotecas de DNA

7. Genoma del Fago

9. cDNA preparado por transcripción
inversa de los mRNA
• Aislar todo el mRNA
• Utilización de la transcriptasa inversa
• Síntesis de DNA apartir de RNA
• Metilación del cDNA
• Clonación
• Corte con enzimas de restricción

10. Sondas de Oligonucleótidos

11. Preparación de sondas especificas con
marca radioactiva.
• Debe de tener longitud suficiente y tener
especificidad.
– Sondas degeneradas
– Sondas basadas en EST exclusivo.

12. Sondas degeneradas
• Fig 7-19 Diseño de sondas de
oligonucleótidos sobre la base de la
secuencia proteica.

13. Sondas basadas en EST exclusivo
• Sonda basada en una secuencia parcial de aa
determinada de una proteína aislada.
• Identifica un único oligonucleótido.
• Secuencias parciales de cDNA de 200–400 pb.
• En base a programas de computación que
aplican el código genético.
• PCR.

14. Identificación, análisis y
determinación de la secuencia de
DNA clonado

15. Aislación de una proteína
Aislar el gen
que la codifica
Biblioteca Biblioteca cDNA
Genómica λ debe contener
completa hasta un clones suficientes
millón de clones de mRNA

16. Hibridación con
sondas de DNA o
RNA marcadas
radioactivamente
Identificar la secuencia
Separacion Escision
del vector
recombinante con
misma E..R

17. Prueba de Hibridación con mb para la
Calentamiento en
detección de Ácidos nucleicos
Si vuelve a sol salina o por
neutralidad se elevación de pH a
forman de nuevo 11
los enlaces Si se lleva a cabo la
reacción en un
Union de sonda a soporte la reacción
cada es irreversible
complementaria

18. Identificación de un clon especifico
de una biblioteca de fago λ por
hibridación con membrana con una
sonda radiactiva

19. Placa maestra de placas
de fago λ sobre un Placas
cultivo de E. coli individuales
Los viriones de fago
recombinantes λ
presentes en un
cultivo de E.
coli se
transfieren a
una membrana Filtro de
de nitrocelulosa. nitrocelulosa

20. Replica de la caja de Petri sobre la
superficie de la membrana de
nitrocelulosa
Se reproduce
sobre la
superficie de la
membrana una
replica de la
placa Petri que
contiene gran
cantidad de
clones λ
La placa madre se refrigera
para almacenar el conjunto
de clones λ

21. La membrana se
incuba en una Se lisan los
solución alcalina fagos y
que deteriora desnaturaliza
los viriones y el DNA
libera y
desnaturaliza el
DNA
encapsulado. DNA

22. La membrana se seca y a su superficie se fija el
DNA recombinante. Por ultimo la membrana se
incuba con una sonda con marca radiactiva en
condiciones de hibridación.
DNA Sonda con La sonda no
monocatenario de marca
radiactiva
hibridada se
fago fijado al filtro
elimina por lavado

23. El filtro se somete a
autorradografia. La
aparición de una
mancha indica la
presencia de un clon
recombinante λ que
contiene DNA
complementario de
la sonda.

24. Las partículas de fago de
una región
identificada de la
placa maestra se
aíslan y se resiembra,
entonces se pueden
obtener aislamientos
puros del clon que
contiene el DNA de
interes.

26. GRACIAS