1) Los marcadores moleculares incluyen ADN, ARN, proteínas y enzimas que se utilizan para identificar variedades y caracterizar organismos. 2) Los marcadores de ADN como RFLP se basan en la digestión con enzimas de restricción y detección de polimorfismos en los fragmentos mediante hibridación con sondas. 3) Las aplicaciones de los marcadores moleculares incluyen mapeo genético, selección asistida por marcadores y backcross avanzado.

1. Marcadores Moleculares

2. Marcadores Moleculares
ADN
ARN
Proteínas
Polipéptidos
Enzimas
Fenotipo

3. Marcadores Moleculares
1) Marcadores proteicos
a) Basadosen amplificación molecular ⇒ PCR
2) Marcadores de ADN
a) Proteínasdereserva
b) Isoenzimas
b) Basadosen hibridación molecular ⇒ RFLP
c) Basadosen amplificación + hibridación molecular ⇒ AFLP

4. Principales aplicaciones de los marcadores
moleculares en fitomejoramiento
1) Identificación genética (genetic fingerprinting).
a) Evaluación de la variabilidad genética preexistente.
b) Clasificación por grupos heteróticos (predicción de la heterosis).
c) Determinación de la "core collections" en los bancos de
germoplasma
d) Certificación de pureza de semillas.
e) Identificación y protección legal de variedades.
f) Caracterización e identificación de patógenos.

5. 3) Otras aplicaciones.
a) Construcción de mapas genéticos.
b) Determinación de homología entre especies relacionadas por
mapeo comparativo.
2) Apoyo a los programas de mejoramiento.
a) Selección asistida por marcadores moleculares.
b) QTLs o "Quantitative Trait Loci" loci de rasgos cuantitativos.
c) Backcross asistido (introgresión rápida de caracteres de interés).
d) Backcross avanzado desde genotipos "no agronómicos" o
especies silvestres

6. Contenido de ADN de algunos organismos y
organelas
Contenido de ADN
Picogramos Pares de KilobasesOrganismo u organela
(pg) (pKb)
E.coli 0,0047 4,2x103
Cloroplasto (Zea m ays) 0,0002 1,6 x102
Mitocondria (Zea m ays) 0,0007 5,7x102
Arabidopsis thaliana 0,07 7x104
Oryza sativa 0,6 5,8x105
Lycopersicum esculentum 0,7 7,1 x105
Zea m ays 7,5 7,2x106
Homo sapiens 3,2 3,9x106
1 pg= 0,965 x 109 paresdebases(pb) = 29 cm
Genomahaploidedel hombre= 3,9 x 10 6
pb
Cadacélulahumanacontiene1,8 m deADN

7. Extracción de ácidos nucleicos
Tipo s de ácido s nucle ico s a e xtrae r: ADNss, ADNds, ARNs
Caracte rísticas de lADN: alto pe so m o le cular y alta calidad.
Pasos generales de un protocolo de extracción a partir de cualquier
tejido y especie:
2) Extracció n de ácido s nucle ico s de lm ace rado ce lular e inactivació n
de co m pue sto s de g radante s
1 ) Lisis ce lular ⇒ Mace rado co n nitró g e no líq uido
Buffer de extracción (pH 8-9) ⇒ Disminuye la acción de ADNasas
Antioxidantes ⇒ Disminuye la formación de compuestos fenólicos
p.e. BSA, β-mercaptoetanol
Detergente + alta concentración salina⇒ acomplejamiento del ADN y
desnaturalización de proteínas
p.e. CTAB +ClNa

8. 3) Purificació n y lavado ⇒ Co m binacio ne s de e xtracció n y
pre cipitació n
Lavado para remover carbohidratos y proteínas ⇒ solventes
orgánicos puros o en mezcla (p.e. fenol o cloroformo:alcohol
isoamílico )
Centrifugación ⇒separación del ADN en suspensión de los
contamientes
Precipitación ⇒ isopropanol o etanol
Puede realizarse un tratamiento con ARNasas o purificación en
gradiente de ClCs para eliminar ARNs y obtener ADN de mayor
pureza.
4) Se cado y re suspe nció n e n e lbuffe r de sto ck

9. Método CTAB

10. 5) Cuantificació n de lADNe xtraído
Fluorómetro: el valor leído se intercala sobre una curva de calibración
previa, y se extrapola la concentración de las muestras.
Espectrofotómetro de luz UV
⇒ Mediciones de absorbancia a longitudes de onda de A 230, A 260, A280,
y A 310
 A 260 / A 280 < 1,8 ⇒ Contaminación con proteínas
 A 260 / A 280 > 1,8 < 2 ⇒ Buena calidad
 A 260 / A 280 > 2 ⇒ Contaminación con fenoles, cloroformo, etc,
Alta precisión, pero pueden verse afectadas por la presencia de
contaminantes como proteínas, polisacáridos y ARNs.
Diluciones con un estándar de ADN comercial de concentración conocida,
con bromuro de etidio. Se observan las diluciones a la luz UV en forma
conjunta con los ADN incógnitas y se estima la concentración por
comparación.

11. Geles de cuantificación (agarosa 0,8%) con marcadores de peso
molecular conocido para cuantificar los ADN extraídos por comparación
de bandas.

12. Marcadores moleculares de ADN basados
en la hibridación
RFLP

13. Enzimasderestricción
 Endonucleasas
Capaces de cortar el ADN en sitios de secuencias de bases
específicas ⇒ Sitios derestricción

14. Tipos de corte
 En el centro de simetría de la secuencia de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos
“romos” o“rasurados
 En diferentes posiciones del eje de simetría de la secuencia
de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos
“cohesivos” o“pegajosos”

15. Origen y secuencias de reconocimiento de algunas
endonucleasas de restricción
Organismo de origen Nombre Secuencia de reconocimiento
Arthrobacter luteus AluI
5´AG CT
TC GA5´
Haemophilus influenzae HindIII
5´A AGCT T
T TCGA A5´
Escherichia coli EcoRI
5´G AATT C
C TTAA G5´
Providencia stuarti PstI
5´C TGCA G
G ACGT C5´
Seconocen másde400 enzimasderestricción

16. Acción de la enzima de restricción EcoRI:

17. Digestión de ADN con enzimas de restricción
Se generan fragmentos de diferente tamaño llamados
segmentos derestricción
El tamaño de los fragmentos refleja la distribución de los
sitios de restricción en el ADN
Estos fragmentos cargados negativamente migran hacia el
ánodo en un campo eléctrico
Durante la electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida, migran en el gel a una tasa proporcional a sus
pesos moleculares
Un ADN pequeño como el de un cloroplasto puede generar
40 segmentos de restricción cuando se digiere con EcoRI

18. Electroforesis de ADN
⇒ Los geles usados en la separación
de ácidos nucleicos son matrices de
agarosa o poliacrilamida, con tramas de
dimensiones moleculares.
⇒ Los ácidos nucleicos están cargados negativamente, ellos
emigran hacia el polo positivo en un campo eléctrico.
⇒ Cuando el campo eléctrico se aplica a
través del gel, las cadenas más cortas se
mueven más rápidamente que las más
largas. Así, las cadenas se extienden en el
gel según su tamaño.

19. ⇒ El ADN do ble cade na puede ser visualizado agregando bromuro
de etidio, un químico aromático que se intercala entre los pares de
bases de la hélice doble. Cuando el bromuro de etidio se halla ligado
al ADN produce, al irradiarse con UV,una fluorescencia naranja.
⇒La diferencia en los
tamaños de los fragmentos
obtenida por la digestión con
enzimas de restricción del
ADN nuclear, de una organela
o el ADN total, se denomina
“RFLP”
RFLP: RestrictionFragment Lenght Polymorphisms
GeldeagarosacoloreadoconBrEt
Calles1y5:Marcadordepesomolecular
Calles2,3,4:ADNde tresplantasdeSolanum
tuberosumdigeridoconEcoRI

20. ⇒LosRFLPdel ADN nuclear no pueden ser
directamentevisualizados.
⇒Paraello seusan pequeños
fragmentosdeADN como sondaso
“pro bes” paradetectar fragmentosde
restricción individuales
Análisis po r So uthern blo t del
ADNde tres plantas de
So lanum tubero sum. La so nda
utilizada es un fragmento del
gen nptII

21. Confección debibliotecasdesondaso “library”
⇒El ADN purificado de
laespeciedeinteréses
digerido con enzimasde
restricción
⇒Losfragmentosderestricción individualesson unidosaplásmidos, y
el plásmido esincorporado aunacélulabacteriana(p.e. E.co li)

22. ⇒ Lassondassemarcan radioactivamentecon P32 (2-5 Kb)
⇒ También puedeusarsetinción no radiactivabasadaen la
quimioluniniscencia(p.e.dioxigenina)
⇒Aislamiento delosfragmentosderestricción delosplásmidos
transformados. Seobtieneun gran número decopiasparaser usados
como sondas
⇒ Semultiplican lascélulasbacterianastransformadas. Los
cultivospueden mantenersepor largo tiempo

23. Detección deRFLPspor latécnicadeSouthern
Blot
Aislamiento y purificación del ADN
Digestión con enzimasderestricción (10-15 u/µg deADN)
Esconvenientehacer un minigel paraverificar ladigestión total
del ADN previo alacorrida
Fracciónamiento y separación delosfragmentosderestricción mediante
electroforesisen gel deagarosa(1%)
Lamigración delosfragmentosdebeser lenta(de6 hasta48
horas)

24. Desnaturalización del ADN por inmersión del gel en solución
desnaturalizante(OHNa+ ClNa)
Seforman cadenassimplesdeADN quepermiten laposterior
hibridación delassondas.
Southern Blot: el ADN monohebraes
transferido del gel aunamembranade
nylon o nitrocelulosa.
Desmontado el Southern selavala
membranaparaeliminar restosde
agarosay seincubaenvueltaen papel
defiltro a80°C parafijar el ADN ala
membrana

25. Procesamiento delasonda
•Lasonda, insertaen un plásmido, esseparadamediantedigestión con
enzimasderestricción y electroforesisen gel deagarosadebajo
punto defusión y purificadamediantecolumnas.
Tratamiento deprehibridización
•Lamembranaestratadacon solución deprehibridización paraevitar
hibridacionesinespecíficasdelasonda
•Cuantificación, ajustedelaconcentración delasonday marcaje
Lasondadesnaturalizadaseagregaalasolución deprehibridización. La
sondahibridacon losfragmentosderestricción homólogosaella.
Revelado por autoradiografía

26. Esquemadelatécnicade
Southern Blot

28. HerenciadelosRPLPs
•Siemprequelosfragmentosreconocidospor lasondasean delongitudesno-
idénticas, decimosquelasbandasson polimorficas.
•Paraestacombinación particular deenzimaderestricción y sondadehibridación,
seobtieneestemodelo dehibridación debandas

29. Flor celeste Flor blanca
Padres
homo cigo tas
Co lo r de flo r
celeste
do minante
RR rr
Rr
RR Rr Rr rr
6 Kb
8 Kb
F1
6 Kb
8 Kb
6 Kb
8 Kb
6 Kb
8 Kb
F2
Lo s RFLPs so n co do minantes

31. Marcadores genéticos convencionales vs
RFLP
⇒ Mayor variación deRFLP seadaptan mejor alaconstrucción de
mapasgenéticos.
⇒ LosRFLPsno dependen del estado dedesarrollo ni delas
condicionesambientalesen lasquecrecedeterminado genotipo
⇒ LosRFLPsposeen bajo efecto fenotípico
⇒ LosRFPLsson codominantesy secomportan deestamaneraen
diferentesfondosgenéticos

32. RFLP Isoenzimas
Elevado número de polimorfismos. Menorvariabilidad.
Permitencrearmapas genéticos
saturados de marcadores.
No existensuficientes marcadores para
unmapa a intervalos pequeños.
Esta mejorcobertura delgenoma
permite determinaradecuadamente
relaciones genéticas entre genotipos.
No se ha encontrado una adecuada
correlaciónentre distancias genéticas
determinadas porisoenzimas y
relaciones genéticas entre genotipos.
Puedendetectarse enprincipio todas las
diferentes mutaciones.
Sólo resuelve aquellas mutaciones que
sustituyanunaminoácido que afecte la
movilidad de la proteína.
Detecciónde la variabilidad no
restringida a regiones codificantes.
Cubre variabilidad engenes
estructurales solamente.
No depende delestadío de desarrollo. Depende delestadío de desarrollo.
No depende deltejido. Depende deltejido.
Herencia codominante.
Herencia codominante pero se complica
cuando la enzima estudiada no es un
monómero.
Sise usansondas genómicas no se
esperanefectos pleiotrópicos pues en
generales variabilidad fuera delgen.
Portratarse de genes estructurales
podríanpresentarefectos pleiotrópicos.
Estudio directamente elgenotipo. Estudio elfenotipo.