Tema10

Tema 10: Clonación y
Dr. Antonio Barbadilla
secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA 1

Objetivos tema 10:
Clonación y secuenciación del DNA

Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?
•Las endonucleasas (enzimas) de restricción
• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación,
organismo huésped, selección de vectores
•Vectores eucarióticos
•Organismos transgénicos
•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
•Mapas de restricción
•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
•La secuenciación del DNA


Manipulación del DNA

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un
fragmento de DNA específico
Esta tecnología se denomina:
Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o
ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La
extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de
DNA complementarios a uno dado


Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias
que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el
esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´



Dos tipos de cortes:
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens •Corte plano:
extremos romos
•Corte escalonado:
extremos pegajosos o
cohesivos

Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en
secuencias específicas, produciendo por tanto una población
heterogénea de fragmentos de extremos idénticos


Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia que
se desea clonar) Vector
híbrido
•Vector de clonación
(vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores



C Vectores
l híbridos
o
(quimera)
n
a Fragmentos de
distintas
c procedencias que
i se unen in vitro
ó tras cortarse con
la misma enzima
n de restricción.
Ligasa sella zona
d híbrida

e Vectores de
l
clonación
•Plásmido (1 sitio
D de corte) 2-15 kb
N •Fago λ
A (Lambda)

•Cósmido

C
Fago λ
l
o Vectores de
n clonación
a
c •Fago λ (2 sitios de
i corte) < 24 kb
ó
n
•Cromosomas
d artificiales P1
e (derivados del
l bacteriófago P1,
pueden aceptar
insertos de 80 y 100
D kb
N
A Dr. Antonio Barbadilla


C Vectores de clonación
l •Cósmido: extremos cos λ + DNA plásmido (origen replicación)
o + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
n
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido
a F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
c
i Cósmido
ó
n

d
e
l

D
N


C
l
o Huésped: E. coli
n
a
Inserción del vector híbrido en el huésped:
c
i
•Plásmido: transformación (solución diluida
ó
cloruro de calcio) y replicación autónoma
n
•Fago λ (transducción, inserción en DNA
d
e huésped)
l
•Cósmido (transducción como fago y
D replicación como plásmido)
N


C Selección de vectores híbridos
l
o •Plásmido: resistencia a antibióticos
n
a
c
i
ó
n

d
e
l

D
N •Fago λ : Inserción en E. coli (sólo se puede
empaquetar el DNA de λ si contiene el
inserto foráneo)

C Obtención de la secuencia que se
l clona
o •Un gen
n •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
a intrones): uso de la transcriptasa inversa que
c hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
i humana recombinante en bacterias)
ó
n •Síntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacídica se puede
hacer DNA con la ayuda del código (no región
d
promotora ni controladora de la expresión)
e ~100bp
l
•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas
D de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
N •Se obtiene genoteca, juego completo
A fragmentos clonados del genoma del organismo


Vectores eucarióticos
Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de
levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de
levadura + (telómero levadura)
Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Resistencia a antibiótico
(p.e., ampr) Origen de replicación
del DNA de levadura
(ARS)

Origen de replicación Región centromérica
bacteriano (ori) (CEN)

Linealización (con
endonucleasas) y adición
de extremos teloméricos

Telómero
ampr ori CEN ARS Telómero


Transfección:
Introducción de DNA foráneo en eucariotas
Organismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo

Métodos transfección
•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con
fosfato cálcico (poco eficiente)

•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma
(ratones transgénicos 15% eficiencia)



•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección
viral)




•Electroporación: se usa corriente eléctrica para
introducir DNA

•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de
membrana artificial)

•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de
proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA

•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y
elementos móviles (Elemento P en Drosophila)



Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos

Población de fragmentos



Separación fragmentos

Reptación
de los
fragmentos
a través del
gel de
agarosa



DNA teñido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV



Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes
fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)
•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA



Transferencia en
Southern
(esquema resumen)



Mapas de restricción
mediante
enzimas de restricción



Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)



La reacción
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)



Usos de la PCR
•Secuenciación

•DNA fósil (evolución,
arqueología, historia) DNA traza

Fósiles
Mamut lanudo (40000

años)

Abraham Lincoln

(síndrome de Marfan,

afecta tejido conectivo,

fribrilina)

Hombre Neandertal ->

Hablaba como nosotros?

Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento más completo de la estructura y
función de un gen.

•La base molecular de mutaciones específicas
en un gen pueden investigarse
•Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
•La comparación de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolución molecular
•Secuenciación de genomas: estructura del
genoma Disoxi

Métodos:
Secuenciación manual (inicial)
Químico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)

Secuenciación automatizada (1986,…)
Clonación y secuenciación del DNA Didesoxi29

Secuenciación del DNA



Secuenciación automatizada del DNA



Animaciones de técnicas de la genética
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html



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