Mi nombre es Jaime Guillermo González Gámez y actualmente vivo en Guadalajara, Jalisco, México. Soy Medico Alergólogo e Inmunólogo, e imparto la materia de inmunología en la UVM Campus Zapopan, también tengo un consultorio privado y trabajo en el Hospital Regional Valentín Gómez Farías No saben como me llena de alegría que bastantes personas puedan aprender de mis presentaciones, cualquier pregunta de los temas no duden en marcar a mis teléfonos, estoy a sus ordenes. Mexicaltzingo #1979 (Col. Americana) 44160 Guadalajara 01 33 3825 3063 01 33 3836 3299 www.facebook.com/jaimeguillermo.gonzalezgamez

1. ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION

2. ¿Qué son?
Una endonucleasa de restricción es una enzimaUna endonucleasa de restricción es una enzima
que se une a una molécula de DNA en unaque se une a una molécula de DNA en una
secuencia especifica y corta la doble cadena ensecuencia especifica y corta la doble cadena en
esa secuencia o cerca de ellaesa secuencia o cerca de ella

3. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción,
la K12 en E coli.
Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se
pensó que reconocía secuencias específicas del DNA.
Se abandonó porque aunque reconocía una zona
determinada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.
En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción en
Haemophilus influenzae, que reconoce una secuencia en un
duplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.

4. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una
bacteria de un DNA extraño y lisis del mismo en pequeños
fragmentos.
El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando
se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece
encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no
encontaremos colonias.
En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago λ, pero
si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de
crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido
por esta cepa.

5. MODIFICACION- RESTRICCION
Ejemplo de
restricción de crecimiento
del bacteriófago lamda
en una cepa determinada
de E. coli
La eficiencia con la que el
fago
crece en una cepa depende
de la
última cepa donde fue
propagado.

6. Explicación:
•El DNA del fago es degradado en cuanto se
incorpora, y a la endonucleasa responsable de esta
degradación se le llama endonucleasa de
restricción o enzima de restricción.
•El huésped restrictivo debe proteger a su propio
DNA de la acción de las enzimas de restricción y
para ello modifica a su propio DNA.
MODIFICACION- RESTRICCION

7. Modificación:
•Metilación de ciertas bases en un número muy
limitado, justo en los lugares de reconocimiento de
las enzimas de restricción.
•El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el
huésped restrictivo se replica y también es metilado
por las metilasas de la bacteria, y por tanto
modificado y protegido, y puede crecer bien en una
nueva reinfección.

8. METILACION Y RESTRICCION

9. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Se conocen cuatro tipos de sistemas de restricción y
modificación:
•Tipo I:
En la misma enzima tienen 2 subunidades parala restricción,
2 subunidades para la modificación (metilación) y una
subunidad para el reconocimiento.
Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.
El corte se da a alguna distancia del lugar de
reconocimiento.
Poco valor para manipulación genética.

10. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
•Tipo II:
La restricción (división) y modificación las provocan diferentes
enzimas de la bacteria, por lo que puede haber división del
DNA en ausencia de modificación.
No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetionina
por lo que su uso es más sencillo.
El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan
al DNA en el lugar de reconocimiento.

11. SISTEMAS DE RESTRICCION Y
MODIFICACION

12. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
•Tipo IIs:
Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre en
Lugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, por
Lo que su uso en ingeniería genética también es reducido.
•Tipo III:
Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se
parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que
son poco útiles.
Algunas enzimas de restricción no entra dentro de
esta clasificación.

13. SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Nomenclatura:
Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró
2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna
cepa especial)
Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica
por números romanos.

14. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Ejemplos:
HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción
HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción
SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción
BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima

15. Endonucleasas de tipo II
Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos,
que tienen un eje rotacional de simetría: Secuencias palíndrome
Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de
restricción
Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por
modificación
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

16. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos
5´que son complementarios entre sí:
5´- G 5´- AATTC - 3´
3´- CTTAA - 5 G - 5´
A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II
se les denomina extremos coheisvos o pegajosos.
No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los
extremos.

17. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Extremos cohesivos Extremos romos

18. ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Para reconocer el tamaño de
los fragmentos que se
producen tras la acción de una
endonucleasa de restricción
se utiliza la electroforesis
en gel de agarosa y la
tinción con bromurod de
etidio.

19. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Se han estudiado 10,000 bacterias para
Encontrar enzimas de restricción.
Se han encontrado 3,000 enzimas de
Restricción específicas para aproximada
mente 200 secuencias de DNA.
www.rebase.neb.com
Las enzimas diferentes que tienen
especificidad por la misma secuencia
de DNA y que cortan en el mismo sitio
se les llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar
al DNA se les denomina neoeschizomeros.

20. RFLP

21. Fragmentos de Restricción de
Longitud Polimorfica.
Es un método utilizado por los biólogosEs un método utilizado por los biólogos
moleculares para seguir una secuenciamoleculares para seguir una secuencia
particular de DNA que se transmite a otrasparticular de DNA que se transmite a otras
células.células.
Es una técnica en la cual los organismosEs una técnica en la cual los organismos
pueden diferenciarse mediante el análisispueden diferenciarse mediante el análisis
de los patrones derivados de la escisión dede los patrones derivados de la escisión de
su DNA.su DNA.

22. Método
1. Extracción de DNA.1. Extracción de DNA.
Puede ser de semen, saliva, sangre o algunaPuede ser de semen, saliva, sangre o alguna
otra muestra biológica.otra muestra biológica.

23. 2. Producción de fragmentos de2. Producción de fragmentos de
restricción.restricción.
El DNA es cortado en fragmentos por enzimasEl DNA es cortado en fragmentos por enzimas
de restricción.de restricción.

24. 3. Los fragmentos de DNA se colocan en3. Los fragmentos de DNA se colocan en
gel de agarosa.gel de agarosa.
Con el propósito de someterlos a unaCon el propósito de someterlos a una
separación en base a su diferente tamaño.separación en base a su diferente tamaño.

25. 6. Southern blotting.6. Southern blotting.
Los fragmentos de DNA separados seLos fragmentos de DNA separados se
transfieren por adhesión a una membrana detransfieren por adhesión a una membrana de
nylon.nylon.
La membrana de nylon es expuesta a sondasLa membrana de nylon es expuesta a sondas
marcadas de DNA ( fragmentos sinteticos demarcadas de DNA ( fragmentos sinteticos de
DNA de secuencia conocida y queDNA de secuencia conocida y que
corresponden a zonas selectas decorresponden a zonas selectas de
hipervariablidad)hipervariablidad)

26. Isotopos radioactivosIsotopos radioactivos Película de Rayos XPelícula de Rayos X
Sustancias fluorescentesSustancias fluorescentes Película fotográficaPelícula fotográfica

28. Aplicaciones de RFLP
Pruebas de paternidadPruebas de paternidad
Determinar el estado deDeterminar el estado de
alguna enfermedadalguna enfermedad
Medir tasas de recombinaciónMedir tasas de recombinación
en un mapeo genéticoen un mapeo genético
Casos penales.Casos penales.