1. CENTRO DE INGENIERI A GENETICA Y
BIOTECNOLOGIA
CUBA

2. Se estableció y valido un ELISA para la
cuantificación del interferón alfa 2b humano
recombinante en el ingrediente F. A.
 LINEALIDAD
 ESPECIFICIDAD
 EXACTITUD
 RANGO
 PRECISION
 ROBUSTEZ

3. Con el desarrollo de la industria
biofarmaceutica se busca métodos de control
de calidad exactos reproducibles y confiables,
por lo tanto se hace la validación de estas
técnicas analíticas para garantizar la obtención
de resultados confiables.

4. REACTIVOS BIOLOGICOS
 Anticuerpos monoclonales (CB- IFN 2.3 & CB-
IFN 2.4) empleados como recubrimiento de
las placas de ELISA.
 MR- grupo de estabilidad y materiales de
referencia de la dirección de control de la
calidad.
 Control +. IFA de IFN alfa 2b humano
recombinante.

6. 30 minutos / 37º C
TAMPON DE ENSAYO (leche descremada al 0.5% en sln salina tamponada con fosfatos)
MR & CONTROL POSITIVO
LOS POCILLOS SE LAVARON 2 VECES
Sln de Tween-20 al 0.05%
37º c / 3 horas
PLACAS DE MICROTITULACION DE 96 POCILLOS
[10 mcg/ml ] CB-IFN 2.3 Sln tampón

7. 5 Lavados con sln Tween-20
al 0.05%
CB-IFN 2.4 diluido 1:80000 en tampón
40 min/ 37ºc
Después de 8 lavados
La reacción fue revelada con ortofenilendiamina
(OPD) al 0.04% como sustrato y en tampón citrato
(PH5.5) con 0.04% de peróxido de hidrogeno.

8. Lectura de absorbancias
492 nm Lector de microplacas
Y se detuvo añadiendo 50 microlitros por
pocillo de una sln H2SO4 2M
La reacción transcurrió en la oscuridad
10 horas y 20 min

10.  La precisión se evaluó mediante la
repetibilidad y la precisión intermedia tanto
para la curva patrón de IFN alfa 2b hu-rec
como para los controles positivos (IFA de IFN
alfa 2b hu-rec).
 La repetibilidad para la curva patrón se
estudio con 5 curvas patrones de forma
independiente en un mismo ensayo & la
precisión intermedia se estudio en 3 ensayos,
evaluándose el comportamiento de las abs
para cada [].

11. Las condiciones de REPETIBILIDAD estipulan
que los resultados pruebas se obtienen con el
mismo método aplicado a idénticos objetos de
prueba en el mismo laboratorio por el mismo
operador con el mismo aparato en poco
tiempo.
 La repetibilidad para las muestras se estudio
mediante la medición de los valores de 15
replicas de una muestra control en una
misma placa por un mismo analista.

12. La PRECISIÓN INTERMEDIA esta basada en
varias combinaciones de tiempo, calibración,
operador y equipos.
 Se estudio con 2 muestras evaluadas a
diferentes diluciones con 1 y 2 analistas
diferentes.
En todos los casos se determino la media, la DE
y el CV, y se considero que el CV fuese inferior
al 10% para el caso de repetibilidad e inferior
al 20% para la precisión intermedia.

13. La ROBUSTEZ es una aproximación alternativa
a los métodos estadísticos clásicos. El objeto
es producir estimadores que no sean afectados
por variaciones pequeñas respecto a las
hipótesis de los modelos.
 El estudio evaluó el efecto borde en las
placas de ELISA y la estabilidad de las
soluciones empleadas utilizando la media +/-
DE, calculado para la posición central de la
placa.

14. ESTABLECIMIENTO DEL METODO
Los criterios de validez para el ELISA:
 DO del fondo= 0.1
 [] del control + del ensayo= dentro del rango
de trabajo calculado & el CV intraensayo
inferior al 10%.
 Coeficiente de determinación de la regresión
> 0.98.

20. Variantes estudiadas ( Centro & Bordes ) se
observa que los valores promedios de [] se
encuentran dentro del intervalo calculado a
partir de la muestra colocada en la posición
central.

22. La variabilidad interensayo obtenida fue
inferior al 20% cumpliendo con los criterios de
validez para este parámetro, lo que confirma
la robustez del ensayo con relación a la
estabilidad de las soluciones.

23. Este método es comparable con otros ELISAs
destacándose entre sus ventajas:
 Sensibilidad hasta 0.5 ng/ml
 Ensayo entre 8 y 10 muestras diferentes
además del control +.
 Tiempo de ensayo corto
 Bajo costo
 Manipulación respectivamente fácil