Se analizan tres factores clave en la catalización de la activida enzimatica de la Amilasa: el pH, la temperatura y la concentración de sustrato. Mediante la puesta en práctica de experimentos estandarizados, se comprueba el efecto de estas variables y sus valores de regulación óptimos.

1. Factores que influyen en
la actividad enzimática de
la amilasa
Aaron Llerena Arroyo
Rosita Riega Mejía
Angie Zacarias Cadillo
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú. Decana de América.
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Escuela Profesional de Ciencia de los Alimentos

2. Objetivos
❏ Elaborar una metodología experimental para demostrar
la influencia de la concentración de sustrato en la
reacción catalizada por la amilasa.
❏ Elaborar una metodología experimental para demostrar
la influencia del pH en la reacción catalizada por la
catalasa.
❏ Elaborar una metodología experimental para demostrar
la influencia de la temperatura en la reacción catalizada
por la amilasa.

3. Influencia del
pH en
actividad
enzimatica
de la
amilasa
1

4. ❏ Determinar la influencia del pH sobre la actividad
enzimática de la alfa amilasa de origen fungico
(Aspergillus oryzae)
❏ Hallar el valor de pH donde se presenta la
máxima actividad enzimática de la alfa amilasa
Objetivos
Diversos estudios consultados muestran la relación entre los
parámetros fisicoquímicos demostrándose que el pH es el parámetro
determinante para la eficiencia máxima de la enzima

5. Materiales
● Tubos eppendorf
1.5ml
● Gradilla para tubos
eppendorf
● Micropipeta
● Papel aluminio
● Espectrofotometro
Uv Vis
EQUIPOS ● Acido 3,5 dinitrosalicílico
● Agua destilada y hielo picado
● Almidón a una concentración de 10 mg/mL.
● Regulador de acetatos a diferentes pH (3, 4,
5, 6, 7, 8) 0.2 M
● Regulador de fosfatos pH 7.0 a 0.2 M
(NaH2PO4, 0.2 M, 200mL y Na2HPO4, 0.2 M,
350mL.
● Solución de Amilasa de origen fungico
(Aspergillus oryzae)
REACTIVOS

6. Procedimiento
01
1. Preparar tubos eppendorf de 1.5 mL, como se
indica en la tabla, adicionando, 0.20 mL de sustrato.
Cubrir tubos con papel aluminio, para proteger de
la luz
2. Adicionar a cada tubo 0.05 mL (50 μL) de la
solución de amilasa (excepto al testigo) con un
intervalo entre cada tubo de 30 segundos para
detener la reacción en el tiempo exacto.
Cantidades de los diferentes reactivos para determinar el efecto del pH en la actividad enzimática de la
amilasa.

7. Procedimiento
02
● Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetatos al pH indicado en la tabla
anterior.
● Incubar los tubos por 15 minutos a 30 oC (o temperatura ambiente).
● Pasado el periodo de incubación, detener la reacción sumergiendo los tubos
en un baño de hielo picado.
Determinación de azúcares reductores por el método de DNS
Se basa en una reacción redox, que ocurre
en la utilización de ácido 3,5 dinitrosalicílico
para provocar la oxidación de los azucares.
1 molde azúcar reacciona con un 1 mol de
ácido 3,5 dinitrosalicílico, dando lugar a una
reacción estequiométrica que permite
conocer la cantidad de azucares reductores
presentes en la muestra.

8. Repetir para los diferentes pH.
● Una vez obtenidas las absorbancias en el espectro, graficar los
diferentes valores de pH contra absorbancia y observar a que
temperatura se visualizó una mayor absorbancia.
● En este valor se observara el pH óptimo de nuestra enzima
Procedimiento
03
Después de esto se continua con la determinación,
haciendo lecturas de absorbancia en el
espectrofotometro a 540 nm.

9. Influencia de la
concentración de
sustrato en la
actividad enzimática
de amilasa
2

10. ❏ Determinar la influencia de la concentración del
sustrato sobre la velocidad de la actividad
enzimática amilasa.
❏ Determinar el efecto que tiene las diferentes
concentraciones de sustrato en la reacción
catalizada por la enzimática amilasa.
Objetivos

11. Materiales
● Tubos eppendorf
● Gradilla
● Vaso precipitado
● Pipeta
● Propipeta
INSTRUMENTOS
● Almidon 10mg/mL
● Agua de grado Millipor
● Suspensión de enzima
de amilasa.
REACTIVOS

12. Preparar tubos eppendorf de 1,5 mL, adicionando el
volumen de sustrato correspondiente.
Procedimiento
1
2
Adicionar a cada tubo 0,05 mL de solución
de amilasa.
3
4
Adicionar 0,5 mL del buffer de acetato.
Incubar los tubos por 15 minutos a la
temperatura optima encontrada anteriormente.

13. Pasado el periodo de incubación, detener la reacción
sumergiendo los tubos en un baño de hielo.
Procedimiento
5
6
Determinar los azúcares reducidos por le
método de DNS.
7 A partir de los valores de absorbancia
y el tiempo de incubación se puede
determinar los valores de actividad
enzimática.

14. Tabla 2: Determinación de la velocidad de reacción a diferentes
concentraciones de sustrato.
Una vez obtenida las absorbancias se graficara respecto al
método de Michaelis-Menten, donde se lograra observar el
comportamiento de tipo logarítmico.

15. Influencia de la
Temperatura en la
actividad enzimática
de amilasa
3

16. Objetivos
❏ Determinar el efecto de la temperatura en la velocidad
de la actividad enzimática de la amilasa.
❏ Determinar el efecto que tiene diferentes niveles de
temperatura en la actividad enzimática de la amilasa.

17. Materiales
● Tubos eppendorf de 1.5 mL
● Gradilla
● Vasos de precipitado
● Puntas para micropipeta
● Probeta
● Espectrofotómetro con celdas
● Parrilla de calentamiento
● Pinzas para termómetro
INSTRUMENTOS
● Almidón de 10 mg/mL.
● Regulador de fosfatos pH 7.0
a 0.2 M (NaH2PO4, 200mL
Na2HPO4, 350 ml)
● Regulador de acetatos 0.2 M
● Solución de Amilasa
REACTIVOS

18. Preparar tubos eppendorf de 1.5 mL
Procedimiento
1
2
Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 ml de
la solución de amilasa (excepto al testigo) con un
intervalo de 30 segundos para detener la reacción

19. Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetatos al pH 5 3
4 Incubar los tubos por 15 minutos a las
diferentes temperaturas indicadas
10, 20, 30, 40, 50, 60 °C
Para esto se montara un sistema en el que se colocaran
vasos precipitados sobre una parrilla, y por termómetros se
estará monitoreando la temperatura de incubación, en este
punto es importante mantener especial atención en el
sistema montado y no pasar del tiempo sugerido.

20. Pasado el periodo de incubación,
detener la reacción sumergiendo los
tubos en un baño de hielo picado.
6
7
Una vez obtenidas las
absorbancias en el espectro,
graficar temperatura contra
absorbancia y observar a qué
temperatura se visualizó una
mayor absorbancia. En este
valor se observa la
temperatura óptima.

21. Gracias