1. Validación Métodos Analíticos Cuantitativos, Cualitativos y Semicuantitativos. Rigoberto Marcelo Yáñez Vera Diciembre 2011

5. LL = L. de linealidad LC = L. de Cuantificación LD = L. de Detección ANÁLISIS CUANTITATIVO Concentración Respuesta del instrumento Intervalo lineal LL LC LD

8. Linealidad: Curva de Calibración IgG INMUNONEFELOMETRÍA Medición instrumental (señal): intensidad de la luz dispersada por los complejos antígenos-anticuerpos .

9. CURVA CALIBRACION IgG CONCENTRACION mg/dL LECTURA 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200

10. CURVA CALIBRACIÓN IgG log conc. log lectura INMUNONEFELOMETRÍA -0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4

11. Exactitud Grado de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado o verdadero Nota: El término “exactitud” cuando se aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la combinación de los componentes aleatorios y de un error sistemático común o de un componente de sesgo (Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

12. Exactitud (Norma ISO 3534-1) -Precisión: grado de concordancia entre resultados de mediciones obtenidas independientes bajo condiciones establecidas. -Veracidad: grado de concordancia entre el valor medio obtenido a partir de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado. Exactitud = Precisión + Veracidad

13. Precisión La precisión depende sólo de la distribución de errores aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor verdadero o el valor especificado. -Repetibilidad -Precisión intermedia o reproducibilidad intralaboratorio -Reproducibilidad (Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

16. REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA LA DETERMINACIÓN IgG. Homogeneidad muestra

18. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG IgG mg/dL DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 1556 1568 1564 1568 1543 1606 1624 1556 1585 1481 1598 1556 1598 1602 1535 1518 1413 1568

19. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG Análisis de Varianza -------------------------------------------------------------------------------------- Fuente var. SC gl CM F P -------------------------------------------------------------------------------------- Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626 Intra grupos 40682,8 15 2712,19 -------------------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 42179,6 17

21. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA PARA DETERMINACIÓN DE IgG MRC DB Lote 084705 931,8 IgG mg/dL 942,3 n = 10 951.8 924,8 918,6 927.1 920,5 938,4 935,2 918,8 Media experimental 930.9 Media certificada 925.0

22. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA PARA DETERMINACIÓN DE IgG Se acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad

23. Incertidumbre Magnitud asociada con el resultado de medición que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente podrían ser asignados al mesurando

24. Incertidumbre -Incertidumbre estándar: Incertidumbre de un resultado de medición expresada como desviación estándar. -Incertidumbre estándar combinada: Incertidumbre estándar como resultado de una estimación mediante la propagación de errores con base en las incertidumbres individuales. -Incertidumbre expandida Incertidumbre estándar que se expresa como un intervalo de confianza .

26. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD Capacidad del método analítico para medir en forma exacta un analito particular dentro de una mezcla compleja, sin interferencia de otras sustancias o analitos. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Magnitud influyente , magnitud que no es el mesurando pero afecta al resultado de la medición (interferencia).

31. LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) Menor concentración o cantidad de analito detectable con razonable certeza por un procedimiento analítico dado. Concentración que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de una muestra blanco. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Y bl = señal promedio del blanco. S bl = desviación estándar del blanco. b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.

32. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC) Es la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Y bl = señal promedio del blanco. S bl = desviación estándar del blanco. b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.

33. ROBUSTEZ: Grado de concordancia de los resultados al efectuar cambios en las condiciones operativas y ambientales normalizadas del método. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN

35. NORMA NCh 2446.Of1999 – Guía para la validación de métodos de ensayo – Principios y conceptos generales 5 Procedimiento de validación 5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditación deben contar con procedimientos y directrices para planificar y controlar el proceso de validación de métodos de ensayo. Sin embargo, la discusión anterior ha indicado claramente que no puede desarrollarse un procedimiento único . En consecuencia, tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de técnicas de validación. Cuán detallada deba ser la validación, depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades, riesgos, etc.).

36. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patologia Molecular SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS: El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, al menos las siguientes características metrológicas: 1.- Error sistemático (sesgo ). El fabricante del calibrador deberá proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado. Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que el proceso proporciona resultados satisfactorios 2.- Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberá proporcionar la información de las interferencias.

37. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patologia Molecular SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS: 3.- Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad Laboratorio. 4.- Límite de detección . El fabricante deberá propocionar especificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección. El Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuando observa diferencia. 5.- Contaminación 6.- Verificar dilución

56. Proporción de muestras sin el analito, cuyo método es negativo: E = VN / (VN + FP) Especificidad (E) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos (FP ) Método negativo Falsos negativos (FN) Verdaderos negativos (VN)

58. Proporción de muestras que contiene el analito cuyo método es positivo: S = VP / (VP+FN). Sensibilidad (S) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos (FP) Método negativo Falsos negativos (FN) Verdaderos negativos (VN)

62. Proporción de resultados correctos : ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN) Exactitud Diagnóstica (ED) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos(FP) Método negativo Falsos negativos(FN) Verdaderos negativos (VN)

64. Resultados métodos Límite de Corte ( cut-off ) Pacientes “negativos ” Pacientes “positivos ”

72. Método ideal ‘ Normal’ Enfermo Valores método No falsos positivos o negativos Nr de individuos

73. Realidad métodos Normal, sin el analito Enfermo, con el analito Valores Método +2SD Falsos Negativos Falsos Positivos Nr de individuos

74. Resultados métodos Sin enfermedad Con enfermedad Verdaderos Positivos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

75. Resultados método Sin enfermedad Con enfermedad Falsos Positivos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Patientes “positivos”

76. Resultados métodos Sin enfermedad Con enfermedad Verdaderos negativos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos ”

77. Resultados método Sin enfermedad Con enfermedad Falsos negativos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

83. Sensibilidad vs. Especificidad. Sensibilidad vs. 1- Especificidad.

84. Lectura de las Curvas ROC * http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/

85. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO - Identificación -Titulo -Protocolo redactado por -Protocolo aprobado por -Objetivo -Alcance -Factores críticos -Selección y tratamiento muestra y MRC -Identificación equipo: certificado calibración -Método analítico: PON -Variables a determinar : análisis estadístico -Personal que desarrollará la validación - Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño -Conclusiones -Registros -Referencias

86. INFORME DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO -Identificación -Titulo -Informe redactado por -Informe aprobado por -Objetivo -alcance -Responsabilidad -Equipo, materiales, documentos -Procedimiento -Cálculos y análisis estadísticos -Criterio de aceptación vs Resultados -Informe de desviaciones -Informe resultados y conclusiones de validación del método

87. Gracias por su atención !!!