MICROPROPAGACION VEGETAL

1. MICROPROPAGACIÓN
1. Introducción.
La microspropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran
escala a través del empleo de técnicas de cultivo “in vitro”.
El cultivo es una herramienta para el mejoramiento ya que se producen
plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo
selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada.
Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células
vegetales, esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando
están sujetas a estímulos adecuados.
Así las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o
embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al
estímulo que reciban.
Esta regeneración ocurre en fases consecutivas:
- Fase de desdiferenciación, donde las células se vuelven
competentes para responder a cualquier estímulo organogenético
o embriogenético.
- Fase de inducción, donde las células se determinan para formar un
órgano o un embrión.
- Fase de realización. Donde se forma el órgano o embrión
propiamente dicho.
Estas fases están directamente afectadas por el balance hormonal del medio
de cultivo. Así en general puede decirse que el proceso de desdiferenciación
generalmente es promovido por una auxina, la de inducción por un balance
hormonal específico del órgano que va a formarse y la de realización por
una disminución de la concentración hormonal en el medio de cultivo.
2. Etapas de la micropropagación
2a. Etapa 0. Preparación del material vegetal.
Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son
1. El tipo de órgano que sirve como explanto

2. 2. La edad ontogenética y fisiológica del mismo. Los órganos jóvenes
o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos de materiales adultos.
3. La estación en la que se colecta el material. Se recomienda la
recolección durante la estación estival o primaveral, cuando existe
una brotación activa de las yemas, el uso de yemas en dormición
ocasiona problemas de contaminación.
4. El tamaño.
5. El estado sanitario general de la planta donante. Es recomendable
hacer crecer las plantas donantes en invernaderos con el fin de
controlar el estado sanitario.
2b. Etapa 1. Establecimiento del cultivo
El objeto de esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito
depende de:
- La edad de la planta donante
- La edad fisiológica
- El estado del desarrollo
- Tamaño del explanto
Los materiales que muestran tener mayor capacidad regenerativa son los
obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, sean yemas axilares o
adventicias, embriones o semillas en plantas herbáceas y tejido
meristemáticos que como el cambium determinan el crecimiento en grosor
de las plantas leñosas.
Las yemas adventicias (yemas formadas de novo) tienen una mayor tasa de
variación somaclonal en cultivo.
Para asegurar las condiciones de esterilidad del cultivo se pueden hacer a
priori análisis que detecten patógenos (ELISA, PCR).
En el momento de manejar el explante se procede a la desinfección del
mismo (etanol, hipoclorito de Na).
Una vez establecido el cultivo, la aparición de hongos y bacterias puede
hacer necesario la utilización de fungicidas y antibióticos.
2c. Etapa 2. Multiplicación
El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes
para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de
ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.)
En esta etapa es conveniente evitar la formación de callo para evitar la
variación somaclonal.
En esta etapa los medios de cultivo, los reguladores del crecimiento como
auxinas, giberelinas y citoquininas y las condiciones de crecimiento juegan
un papel muy importante sobre la multiplicación clonal de los explantos.
Existen dos vías de regeneración, ambas pueden darse directa o
indirectamente a través de la formación de callo:
- Organogénesis. Mediante la inducción de yemas axilares o
adventicias.
- Embriogénesis

3. La embriogénesis somática es una vía más conveniente porqué permite
saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento, regenerando
plantas de una forma más rápida y eficiente, disminuyendo además el
riesgo de variación somaclonal y además disminuye costos para su
implementación a escala comercial.
Los principales problemas de esta etapa son la vitrificación y la acumulación
de compuestos fenólicos.
Las condiciones culturales en las que crece el explanto son el resultado de
la interacción de tres factores:
- El estado del explanto o material vegetal (determinado en parte por el
medio de cultivo)
- El recipiente de cultivo
- Condiciones del cuarto de cultivo
La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo
cambia con:
- El número de subcultivos
- El tipo de explanto subcultivado
- Método de repique.
Por esto mismo el medio de cultivo debe optimizarse a fin de lograr la
mayor tasa de multiplicación vegetativa. Comúnmente se usa como medio
basal el MS complejo (Murashige and Skool, 1962) suplementado con un
30% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan
auxinas y citoquininas.
La etapa de multiplicación comprende dos periodos
- Fase de inducción. Implica el empleo de altas concentraciones de
reguladores del crecimiento (generalmente de auxinas más que de
citoquininas), para favorecer la desdiferenciación
- Fase de multiplicación propiamente dicha. Requiere un balance
hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación
y multiplicación celular(en este caso el sistema es más dependiente de
citoquininas).
2d. Etapa 3. Enraizamiento y aclimatación
En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias más fácilmente
en las herbáceas que en las leñosas dada su limitada capacidad rizogénica.
Puede realizarse el enraizamiento in vitro o ex vitro.
In vitro:
-Sustrato: medio solidificado con agar, perlita o vermiculita humedecidos
en medio nutrtivo o H2O
- Auxinas: promueven rizogénesis a concentraciones elevadas. La más
utilizada es el IBA (ácido 3-indolbutírico) a concentraciones de 1-10 μM
unas pocas horas (altas concentraciones de auxinas pueden inducir la formación de callo
por lo que para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizogénesis).
Posteriormente se transfieren los vástagos a un medio sin reguladores de
crecimiento para permitir el desarrollo de las raíces. Aproximadamente a los

4. 20 días se observan una cantidad adecuada de raíces funcionales que
permiten que se continúe con la etapa de aclimatación.
Ex vitro: Permite enraizamiento y aclimatación simultaneamente. Sin
embargo el estrés debido a la evapotranspiración acelerada de las plantas
en las primeras etapas de l transplante pueden reducir mucho se
supervivencia.
Se utilizan distintos sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos que
convienen que estén esterilizados. La aclimatación debe llevarse a cabo en
invernaderos o cámaras con temperatura y humedad relativa moderadas.

5. Cultivo in vitro
Definición
Cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas,
semillas, embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos, debido a la
propiedad de totipotencia de las células vegetales.
ETAPAS DEL CULTIVO IN VITRO
1. ELECCIÓN DEL EXPLANTE
2. PREPARACIÓN MEDIO DE CULTIVO
3. DESINFECCIÓN EXPLANTE, MEDIO Y MATERIALES
4. CULTIVO DEL EXPLANTE EN SU MEDIO EN CONDICIONES DE
ASÉPSIA
5. DESARROLLO DEL CULTIVO EN CÁMARA EN CONDICIONES
DETERMINADAS
1. Preparación del medio de cultivo.
Los alumnos prepararán medio ACM de enraizamiento, siguiendo el
protocolo facilitado y a partir de soluciones madres ya constituidas. Una vez
preparado lo distribuirán en vasos de cultivo que serán precintados y
envueltos en papel para su siguiente esterilización.
2. Cultivo del explante en su medio
- Cultivo de ajo en un medio MS + 2,4, D con el fin de obtener callo
para saneamiento vegetal
- Germinación de semillas de Jatropha en un medio MS 50% sales.
- Medio ACM de proliferación. Para chopo.
- Medio ACM de enraizamiento. Para chopo.
- Medio MS de proliferación donde se cultivará Paulonia.