Cultivo de tejidos

1. Cultivos de tejidos vegetales y
micropropagación in vitro
Escuela de Bachilleres Ricardo Flores Magón
Maestra: Dr. Carmen Sol de la Peña
5° “A”
Isaac Joab Hernández Díaz NL: 19
Yesenia Estefanía Jiménez Maza NL: 20

2. Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales es una serie de técnicas y procedimientos que nos
permiten la manipulación en condiciones artificiales y perfectamente controladas
de células, tejidos y órganos vegetales, así como de plantas completas.
El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de
botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una
herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de
enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes
plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre
hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se
combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los
microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de
microorganismos e identificación.
Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de
plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual
controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta
precisa de nutrientes en un recipiente estéril.
A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo
de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir
material vegetal libre o saneado de patógenos, de alta calidad, que puede
atravesar fronteras internacionales.
Sobre un enfoque más técnico, esta metodología ha provisto a la industria de
cruzamiento, de las metodologías apropiadas para generar, almacenar o
manipular germoplasma de valor o genéticamente inestable sobre su camino a
través del proceso de cruzamiento, donde el vehículo eventual para la
propagación será la semilla.
 ¿Qué es el cultivo de tejido vegetal?
El punto de partida para el cultivo de tejidos es la iniciación. Este es el proceso por
el cual se trae material vegetal en un medio de cultivo estéril. Requiere la
disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con
el propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente
(los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente
estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que
crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerán de los objetivos del
cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa
aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes

3. otras estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros
órganos.
Estos tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril de un
recipiente de vidrio o de plástico; y son protegidos del medio exterior no estéril. Es
esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente,
debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá
oportunamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y
eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos
crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse
además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los
apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso
solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. Ellos también
necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son
esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas,
azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales que se
conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos
compuestos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y
esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en
uno separado.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es
necesario el suministro de luz, pero a intensidades muy bajas, mucho más que la
de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos
provendrá de los azúcares agregados al medio, más que de la fotosíntesis, de
manera que son innecesarios unos altos niveles de luz.
Una temperatura controlada también es necesaria para estabilizar el crecimiento y
mejorar la predictibilidad del desarrollo de los tejidos.
 Facilidades requeridas para el cultivo de tejido
Ciertas facilidades son requeridas para que el cultivo de tejidos sea efectivo. Están
involucradas dos fases de actividad.
1. El laboratorio - una habitación limpia conteniendo un número de estaciones de
trabajo, cada una proveyendo aire filtrado - gabinetes de flujo de aire laminar
estéril- en los cuales el material puede ser manejado sin riesgos de contaminación
por el operador y transferido en forma segura a medios nutritivos frescos. Esta
transferencia es el paso de manufactura individual en el cual los tejidos que
crecieron previamente en medio de cultivo son manipulados y subdivididos con

4. escalpelo y pinzas dentro del medio ambiente estéril del gabinete de flujo laminar,
de manera de transferirlos a nuevo medio de cultivo y un nuevo recipiente para
posterior crecimiento, multiplicación o desarrollo, y
2. El cuarto de crecimiento - una habitación iluminada, con aire acondicionado y
con alto estándar de higiene en el cual los cultivos de tejidos pueden crecer y
desarrollarse en forma segura por períodos de semanas o meses. Un régimen de
iluminación y temperatura óptimas requiere un suministro de electricidad confiable
y adecuada, ya que cada planta producida puede consumir unos 0,5 kW de
energía.
 Propagación de material vegetal por cultivo de tejido
En los años 60s se reconoció lo que el cultivo de tejido podía ofrecer a la
horticultura y la agricultura y esto proveyó un estímulo para la evolución de la
tecnología. Particularmente los beneficios aparecían en aquellas especies de
cosecha donde existían algunos problemas de propagación. Por ejemplo, donde la
producción de semillas es limitada, o las semillas no originan plantas veraces al
tipo, o la propagación por medio de bulbos, tubérculos o esquejes es muy baja. La
habilidad del cultivo de tejido para acelerar la multiplicación de líneas nuevas
obtenidas por cruzamiento acelera su evaluación, y las puede colocar rápidamente
en mercado. Este fue un avance radical para los mejoradores de estas cosechas.
Además, donde hay una necesidad por un reemplazo rápido o anual con material
sano nuevo en una escala confiable de tiempo.
Hoy día, hay muchas especies donde el cultivo de tejidos se ha vuelto un método
regular y establecido de propagación, por ej. para la papa, dátiles, banana, un
amplio rango de cultivos para flor cortada y numerosas plantas ornamentales de
maceta.
El mayor beneficio del cultivo de tejido en la propagación de plantas es el
dramático acortamiento del tiempo de producción. Por ejemplo, la papa se puede
multiplicar convencionalmente por medio de tubérculos crecidos a campo en
aproximadamente un factor de 10 por año, pero en cultivo de tejido puede hacerlo
por un factor de 5 por mes, lo cual equivale a 1/4 de billón por año.
 El cultivo de tejido viene a asistir a los mejoradores
Numerosos procesos y manipulaciones son llevados a cabo sobre las plantas en
cultivo de tejido. Están desarrollándose constantemente nuevas técnicas y es
definitivamente difícil resumirlas.
La propagación por cultivo de tejidos normalmente intenta preservar y copiar
fehacientemente la identidad exacta de una línea varietal de plantas. Sin embargo,
ligeras variaciones existen entre la identidad genética de células individuales

5. dentro de los tejidos. Esta variación somaclonal, que siempre está presente y es
una amenaza a la estabilidad en la micropropagación, puede ser útil para el
mejorador vegetal debido a que puede representar formas latentes y noveles de la
planta.
Las modificaciones de los procesos en cultivo de tejidos se han desarrollado para
estimular el crecimiento y selección de nuevas líneas de cultivos de tejidos que
puedan revelar características mejoradas después de la selección en el campo o
invernadero.
El cultivo de protoplastos es otro método desde donde se puede originar variación
somaclonal para el desarrollo de nuevos tipos de plantas. Los protoplastos son
células vegetales a las cuales se les ha removido la pared celular rígida. Se han
desarrollado técnicas especiales con la finalidad de liberar protoplastos desnudos
desde los confines de sus paredes y permitir que cada protoplasto individual
pueda regenerar en cultivo de tejido hacia una planta.
La hibridización somática es una técnica que puede permitir que diferentes
especies de la misma familia sean cruzadas. Esto es usualmente imposible
siguiendo el proceso normal de regeneración sexual de las plantas. Estableciendo
cultivos de protoplastos de cada especie, los cultivos pueden ser mezclados y
algunos protoplastos de cada especie se fusionarán al azar. Por una cuidadosa
selección y cultivo, se podrán regenerar plántulas desde estos protoplastos
híbridos y ser ensayados por características deseables in vivo.
El rescate de embriones es un proceso de laboratorio por el cual un huevo
fertilizado o un embrión pueden removerse desde una planta y hacerse crecer y
desarrollar en cultivo de tejido estéril hasta que pueda crecer en forma segura o
sin ayuda. El huevo fertilizado usualmente proviene de genitores de valor donde el
embrión falla en desarrollarse normalmente en la planta. Esto es de ayuda para el
mejorador pues lo asiste en las cruzas entre subespecies en las cuales pueden
haber evolucionado barreras naturales para la cruza. Ha sido particularmente útil
para el mejoramiento en azucenas.
Los bancos de germoplasmas pueden ser maneras útiles de almacenar material
vegetal, semillas o cultivos de tejidos, los cuales tienen características reconocidas
y de valor y por esto merecen un control adecuado y seguridad de mantenimiento.
Los biólogos moleculares involucrados en ingeniería genética pueden mantener
una colección de plantas en la forma de cultivo de tejidos, los cuales poseen
características heredables identificables (genes) que pueden ser de utilidad para
insertarlas en los genes de otras plantas. Esto es de utilidad a los mejoradores
para lograr nuevas variedades de cultivos.
 Micropropagación
Es una técnica que nos permite la obtención de millones de plantas a partir de
pequeñas secciones de tejido vegetal, llamadas explantes, esto en un espacio y

6. tiempo reducidos. Otra ventaja es que al tratarse de un sistema de propagación
colonial (las plantas hijas son exactamente iguales a la progenitora), es posible
obtener un numero prácticamente infinito de plantas iguales a partir de una que
muestre características deseables (planta elite).
Las desventajas de este método son de requerir un equipo especializado y
personal capacitado.
La micropropagación puede hacerse por tres vías diferentes:
1. Elongación de meristemos ya existentes (yemas), es la más sencilla.
2. Inducción de brotes adventicios, que consiste en la desdiferenciación de
ciertas células, seguida por la rediferenciación de cada una de ellas en un
brote o pequeña planta, la que se enlonga y enraiza para obtener la planta
completa.
3. Embriogénesis somática, consiste en la obtención de un gran número de
embriones a partir de células somáticas sin que existieran procesos
sexuales.
La estimulación de las yemas axilares o adventicias es el proceso más común que
se conoce para la micropropagación de las plantas. Aquí, las citocininas causan
una generación contínua de estas yemas en la base del cultivo que prolifera. Cada
yema desarrolla en un tallo enanizado el cual a su vez puede producir más yemas
en su base. Esta proliferación de tallos y yemas continuará siempre que sea
mantenido un suministro adecuando de citocinina junto con nutrientes y espacio
físico por subdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos a medio fresco
cuando sea necesario.
Alternativamente, el tallo puede separarse del suministro de esta hormona, la cual
tiende a suprimir la formación de raíces, y ser transferido a medio nuevo
conteniendo una hormona del grupo de auxinas, la cual estimulará el desarrollo
radicular en la base del tallo. Tales tallos enraizados pueden transferirse luego
afuera del ambiente estéril del cultivo de tejido y, con cuidadoso control de
humedad y luz, ser aclimatada para volverse una planta que crece
convencionalmente en forma dependiente de la fotosíntesis.
La embriogénesis es otro método que puede usarse para propagar las plantas en
masa. Como indica su nombre, esta técnica causa que se formen embriones
generados desde el tejido en cultivo, proceso que por otra parte sólo ocurre en la
formación de una semilla. Bajo el control de ciertas mezclas hormonales se forman
los embriones dentro de una masa aparentemente desorganizada de un callo, en
el cual nódulos de células comienzan a desarrollarse en forma que recuerda la
estructura de un embrión de semilla. Si estos embriones se trasladan a otros
medios, desde los callos, medios que están diseñados para permitir que el
embrión germine, entonces desarrollará una estructura de planta completa, esto
es una plántula, un talluelo enraizado que no difiere mayormente de la obtenida
desde semilla. Como las plantas obtenidas por caulogénesis axilar o adventicia,

7. estas plántulas también pueden aclimatarse para transformarse en una planta
viable con capacidad de fotosíntesis.
Las ventajas de este método es que permite obtener muchos individuos iguales en
una pequeña superficie, controlar las condiciones ambientales, estudiar diversos
procesos de las plantas y evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se
realiza en medios esterilizados). Constituye uno de los métodos que mayores
logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción
masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y
forestales.
 Equipo necesario para la micropropagación in vitro
Autoclave
Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes,
material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de
mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).
Cámara de flujo laminar
Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con
un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el
aire.
Medio de cultivo
Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón.
Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco
inclinado.
o Medio Basal
Éste incluye:
-Agua
-Macroelementos: N, P, K, Ca, S, Mg.
-Microelementos: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Ni, Co, Al, Mo, I.
-Carbohidratos
-Vitaminas
-Aminoácidos
El medio basal puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento u
hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas, acido abcísico) y ocasionalmente
con otras sustancias (extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales,
hidrolizados de caseína, peptona y triptona).
Debido a que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas
cuando se desarrollan en estas condiciones, se les debe añadir carbohidratos.

8. o Medio solido: aquel que contiene un agente gelificante.
-La dureza del medio depende del pH y de la composición química del medio.
-El agente gelificante más empleado es el agar.
-Agar: mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina.
-La planta no puede digerirlo ni adsorberlo
-No interactúa con los componentes nutritivos del medio.
-El agar se funde a altas temperaturas (100ºC) y solidifica alrededor de los 40ºC
-No se degrada con la luz.
-Generalmente se utiliza a una concentración de 0.6 - 1%.
-El principal problema es su elevado costo.
o Medio liquido: no requiere de agentes gelificantes.
-Facilita la absorción de nutrientes por el explante.
-Manipulación más sencilla para cambiar medios.
-Cualquier exudado de la planta se diluye con mayor facilidad.
-Algunas especies que crecen mal en medio líquido.
-Si resulta posible el cultivo en medio líquido, se debe considerar el problema de la
aireación. Se puede cultivar el explanto parcialmente sumergido, y si se necesita
una inmersión total se debe utilizar un agitador.
o Función del medio de cultivo
Es importante encontrar condiciones de cultivo no sólo para que las células
crezcan y se dividan rápidamente sino también para que la mayor parte de ellas
expresen su capacidad de rediferenciación y biosíntesis para una o varias
substancias de interés. En varios de los estudios sobre cultivos de células y tejidos
vegetales esto se ha tratado de resolver variando los componentes de los medios
de cultivo (Martin 1980, Yasuda et al 1972, Calva y Ríos 1999) y las condiciones
físicas y fisicoquímicas de los procesos (Fowler 1982, Rhodes et al 1987),
aprovechando las ventajas que ofrece la rápida respuesta de las células in vitro
ante pequeños cambios en su medio ambiente con respecto a las plantas crecidas
por métodos tradicionales.
Los primeros medios utilizados en cultivo de células y tejidos vegetales fueron
semisintéticos. Frecuentemente contenían extractos o complejos orgánicos como
agua de coco, hidrolizado de caseína y extracto de levadura. Actualmente, la
mayoría de los medios son de composición conocida (Tabla 2), estando
constituidos básicamente por cinco grupos de ingredientes: nutrientes inorgánicos,
fuente de carbono, fuente de nitrógeno, vitaminas y reguladores del crecimiento
que in vivo son sintetizados por una parte u órgano de la planta para luego ser
transportados a otros órganos donde se metabolizan y/o acumulan (Seabrook
1980, Yasuda et al 1972). Las fuentes de nitrógeno más comunes son el nitrato y
amonio, pero también se han utilizado urea, hidrolizado de caseína, extracto de
levadura y aminoácidos, entre otros. La fuente de carbono más empleada es la
sacarosa o glucosa y en menor grado la maltosa, galactosa, almidón y melaza.
Los micronutrientes, generalmente adicionados al medio de cultivo en forma de
sales, son utilizados por las células como cofactores enzimáticos, como el

9. molibdeno para la nitrato reductasa y el magnesio para algunas cinasas
(Murashige y Skoog 1962, Shenk y Hildebrandt 1972).
Las fitohormonas y sus inhibidores son substancias producidas por las plantas y
regulan su respuesta a estímulos ambientales como luz, temperatura y humedad,
ayudando de esta manera a regular y coordinar los procesos esenciales para el
desarrollo normal de las plantas (Wain 1980, Doerner 2000, Crozier et al 2000).
Este tipo de substancias se pueden dividir principalmente en auxinas, giberelinas,
citocininas, ácido abscísico, etileno, brasinoesteroides, poliaminas, ácido
jasmónico y el ácido salicílico.
Las auxinas y giberelinas promueven el alargamiento celular pero inhiben la
diferenciación, mientras que las citocininas estimulan la división mediante la cual
se producen nuevas células y pueden también evitar el envejecimiento celular.
El etileno estimula la maduración principalmente de frutos, el ácido abscísico
inhibe la acción de las auxinas, giberelinas y citocininas operando como sistema
de defensa natural contra efectos de estrés fisiológicos. Las más usadas en
cultivos de células vegetales son las auxinas y citocininas. De las auxinas, el ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es la más usada para la inducción y
mantenimiento de tejido calloso debido a que suprime severamente la
organogénesis. De las citocininas, la más activa es la 2-indolaminopurina (2iP); sin
embargo, las más utilizadas en cultivo de células vegetales son la
bencilaminopurina (BAP) y la cinetina (Cin), una citocinina sintética afectada por la
luz en el rango de longitud de onda de 300-800nm (Aitchison et al 1977, Street
1969 y 1977, Crozier et al 2000).
Planta
El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto
riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más
corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla
menos infecciones.
Cámara de cultivo
La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que
se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche,
etc..
 Condiciones del cultivo in vitro
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema
más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.
En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas,
antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni
tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

10. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre sustancias
contaminantes al medio para la planta. Normalmente se prepara el medio y se
filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas
sustancias.
Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos
no se puede hacer el medio de cultivo.
El pH ideal puede oscilar entre 5,2 y 5,8. Valores menores a 3.5 impiden la
solidificación de los agentes gelificantes añadidos al medio sólido, un pH bajo
afecta la absorción de determinados nutrientes por parte del explante.
Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.
El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía
(azúcares) y reguladores de crecimiento.
El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.
En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas).
También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad.
Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones
se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.
Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen
determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo
de implante, parte más juvenil o más adulta.
En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la
pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por
tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.
 Etapas de la micropropagación
Etapa 0: Elección y preparación de la planta madre.
o Crecimiento en condiciones de sanidad controlada.
o Tratamientos de rejuvenecimiento.
o Pretratamientos con reguladores de crecimiento.
Se obtiene el explante con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado
para lo cual es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo
que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que
se va a cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la
nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.

11. Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia.
Escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos de la planta madre, los
cuales son desinfectados para luego obtener los explantes.
En condiciones de asepsia (en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes
del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un
tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.
o Procedimiento:
1. Cortar brotes con características juveniles.
2. Lavar con agua y jabón.
3. Se descartan las hojas, se dejan los pecíolos.
4. Realizar la desinfección con etanol, hipoclorito de sodio,etc.
5. Realizar tres enjuagues con agua destilada estéril.
6. Cortar segmentos nodales, descartando los extremos basal y apical.
7. Cada nudo contiene un meristemo axilar.
8. Introducir un segmento nodal por tubo de ensayo conteniendo el medio de
cultivo.
9. Tapar y colocar en cámara de crecimiento.
o ¿Cuáles son las principales limitantes en esta etapa?
Contaminación por hongos, bacterias, virus, Mycoplasmas, Microartrópodos, Trips
oxidación.
o Principales causas de contaminación fúngica:
•Esterilización superficial inadecuada
•Manipulación
•Introducción de esporas por Trips
o Géneros de hongos más frecuentes:
•Aspergillus
•Candida
•Cladosporium
•Microsporium
•Phialophora
o Bacterias:
•Principal agente contaminante.
•Síntomas sobre el explanto o en el medio de cultivo.
•Pueden aparecer luego de varios subcultivos.
•Síntomas no visibles, plantas que no sobreviven la aclimatación.
•(Bacterias no patogénicas, benéficas)
o ¿Cómo puede solucionarse?
Hongos: Adecuada desinfección
Bacterias: Antibióticos

12. Uso humano y animal
Efecto bacteriostático/bactericida
Virus: Cultivo de meristemas y termoterapia
o Oxidación:
•Amarronamiento del explanto y/o el medio.
•Inhibición del crecimiento y muerte del explanto.
•Más marcado en especies que naturalmente tengan altos niveles de taninos u
otros compuestos fenólicos.
o Causas:
•Acción de enzimas oxidasas que son liberadas o sintetizadas en respuesta a
heridas.
•Sustratos distintos según el tejido.
•Fenoles se oxidan a quinonas que a su vez tienen alto poder oxidante sobre
proteínas.
o ¿Cómo puede solucionarse?
•Agua estéril 2-3 hs previo a la introducción.
•Empleo de antioxidantes en el último enjuague o en el medio de cultivo (ácido
cítrico, ascórbico).
•Transferencias frecuentes (cada dos o tres días) a medio fresco.
•Carbono activado.
•PVP
Etapa 2: Multiplicación de los brotes
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la Fase I
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio
mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes
adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar
o Procedimiento:
1. Extraer los explantos que brotaron en la etapa previa.
2. Cortar separando brotes individuales o segmentos nodales (según el hábito
de crecimiento de la especie).
3. Separar los brotes por tamaño.
4. Colocar en medio de multiplicación.
o ¿Cuáles son las principales limitantes en esta etapa?
o Variación somaclonal
Variación genética heredable, que surge en plantas producidas por cultivo de
tejidos.Desventaja importante cuando el objetivo es la fidelidad clonal.

13. o ¿Cómo puede solucionarse?
•Reducir el número de repiques.
•Uso racional de reguladores de crecimiento.
•Evitar el 2,4 D.
Fase 3: Elección de un medio de enraizamiento de los explantes
Para enraizar los explante se utilizan 2 métodos:
o Enraizamiento in vitro
•Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio
libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas.
•Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar.
o Enraizamiento ex vitro
•Los explantes se deben transferir a un sustrato, que puede ser una mezcla de
turba con perlita o vermiculita.
•Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de
organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya
que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía
para enraizar y desarrollarse.
•Los explantes deben de plantarse en cámaras plásticas en el laboratorio.
Fase 4: Aclimatación de los explantes enraizados
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales; el
éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
•En el momento en que se extraen los explantes de los recipientes de
enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero.
•Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad y luz del
invernadero antes de ser trasplantados a un área determinada.
PLANTAS OBTENIDAS IN VITRO:
•Hojas delgadas
•Tallos débiles
•Raíces débiles y poco funcionales
•Conexión tallo-raíz incompleta
•Baja tasa fotosintética
PROCESO GRADUAL:
•Disminución de la HR
•Crecimiento autotrófico
•Condiciones sépticas

14.  Dificultades que presentan las especies leñosas in vitro.
•Menor capacidad regenerativa
•Efecto de dormancia en yemas
•Inducción de rejuvenecimiento
•Menor tasa de multiplicación
•Mayor oxidación inicial del explante
•Desinfección más dificultosa
•Enraizamiento y aclimatación limitantes
 Costos de la micropropagación
Capital para la instalación del laboratorio
Costo de la mano de obra
Costo de los materiales
Características del comportamieno in vitro del material a propagar
• Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc.
• Tasa de multiplicación
• Enraizamiento in vitro/ex vitro
Pérdidas que ocurren en cada etapa del proceso
• Contaminación
• Hiperhidricidad
• % plantas que no enraizan
• % plantas que no sobreviven la aclimatación
 Principales plantas que se reproducen por la micropropagación
o Clavel
o Petunia
o Violeta africana

15. o Gloxínea
o Anturuim
o Orquídea
o Papa
o Clavel
o Rosa de tallo largo
o Ave paraíso
o Flor de Lis
o Eucalyptus grandis
o Acca sellowiana
o Actinidia deliciosa
o Allium cepa
 Laboratorios establecidos en México
o Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCVT) de la Facultad de Química
de la UNAM
o Laboratorio del Departamento de Química de la UAA
o ININ
o Jardín Botánico de la UNAM
o Universidad Autónoma del Estado de México (UAEM)
o Universidad Autónoma de Chapingo (UACH)
o Laboratorio de Cultivo de Plantas de la Facultad de Ciencias Biológico-
Agropecuarias de Peñuela (zona Córdoba-Orizaba)
o Agromod
 El uso de cultivo de tejidos vegetales en la lucha contra
enfermedades
Los virus y otros patógenos que invaden los tejidos vegetales en forma
sistemática, pueden ser muy dañinos para la eventual producción o calidad de la
cosecha, como ocurre por ejemplo en papas y crisantemos. Las enfermedades
virales son difíciles de controlar efectivamente, porque a menudo es difícil
diagnosticar que una planta está infectada y la pérdida en la producción puede ser
la primera indicación y no hay productos químicos que a campo puedan controlar
la infección.
El cultivo de tejidos ofrece un número de ventajas para la prevención de virus
vegetales. El cultivo de vegetales que es iniciado dentro de cultivo puede ser
ensayado por métodos serológicos específicos por la presencia de virus
conocidos. Así, la iniciación de plantas libres de virus puede ser asegurada.
Estos cultivos tipificados por ausencia de virus podrán luego propagarse
rápidamente en cultivo de tejido por distribución de nuevos stocks sin el temor de

16. propagar virus que podrían haber estado incluidos en las plantas. Durante esta
rápida propagación en cultivo no hay riesgo de una reinfección con virus lo cual
podría ser posible durante la propagación de nuevos stocks saludables en el
campo o en el invernadero.
Si, por otro lado, se encuentra que una planta de valor que no puede
reemplazarse contiene virus, el cultivo de tejido ofrece otra solución, la eliminación
del virus por cultivo de meristema. El pequeño número de células que rodea el
punto de crecimiento o meristema de la planta generalmente crece muy rápido de
manera que es poco probable que esté infectada con el virus. Y si una pequeña
pieza de tejido conteniendo el meristema es cortada con sumo cuidado y colocada
en un medio de cultivo, luego después de algunos meses para la recuperación y
crecimiento del tejido, puede aparecer un nuevo cultivo libre de virus.
 Referencias
Articulo Micro propagación de plantas de ornato
Programa de investigaciones Biológicas
Ing. Hugo Lizalde Miramontes
M. en C. Eugenio Pérez Molphe
M. en C. Rafael Gutiérrez Campos
Laboratorio de fisiología vegetal
Cultivo in vitro
POR: Débora Frid, 2009
http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm
Cultivo de tejido vegetal
Traducción del trabajo del Dr. W.M. Morgan, del International Plant Laboratories,
Baltonsborough, UK.
Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el futuro
Dr. Graciano Calva Calva
Investigador responsable del laboratorio de Ingeniería Metabólica del De-
partamento de Biotecnología y Bioingeniería del Centro de Investigación y
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, México.
Dra. JosefinaPérezVargas
Coordinadora de la Maestría en Ciencias en Ingeniería Bioquímica del Tecnológico
de Estudios Superiores de Ecatepec, Estado de México, México.
Revista digital universitaria
http://www.manufactura.mx/industria/2012/05/29/el-cultivo-de-tejidos-vegetales
http://www.agromod.mx/micropropagacion/
http://www.uv.mx/gaceta/Gaceta55-56/55-56/ser/Seraca01.htm