Espectofotometria

1. Práctica 3
Espectrofotometría
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela Profesional de Medicina
Humana
Bioquímica
Docente :
Msc. Halder Santiago Isla Peche.

2. COMPETENCIA
 Explica las bases teóricas del uso y
funcionamiento de un espectrofotómetro
 Comprende el concepto de Espectrofotometría.

3. La espectrofotometría
• Se ocupa de la medición de la interacción de la luz con la
materia.
• La luz se puede reflejar, transmitir, dispersar o absorber.
• Un material puede emitir luz, ya sea porque ha absorbido algo
de luz y la reemite, porque ha ganado energía de alguna otra
manera (electroluminiscencia), o porque emite luz debido a
su temperatura (incandescencia

4. • El principio básico es que la mayoría de las moléculas
absorben luz en un cierto rango de longitudes de onda en las
regiones ultravioleta y visible del espectro (185 a 700 nm).
• Consta de una fuente de luz, un monocromador o un filtro
para seleccionar una banda de longitud de onda de la luz que
luego pasa a través de una solución en una celda (cubeta)
antes de ser medida por un detector. La proporción de la luz
absorbida se utiliza para obtener el nivel de un analito en
solución.

5. La espectrofotometría es la capacidad de las moléculas
para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones
dentro del espectro UV-visible.

6. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible
Método instrumental óptico basado en la medida
directa de la absorción de radiación electromagnética
UV-Visible, por las moléculas del analito contenido en la
muestra.
• La región ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la
región visible comprende entre 350 y 750 nm.
• Las radiaciones UV y visible tienen en común el hecho de
que la absorción de ambas regiones por moléculas,
provoca la excitación de e- de enlace a niveles de E
superiores.
• Los picos de absorción pueden correlacionarse con los
tipos de enlaces de la especie absorbente, base de su
aplicación cualitativa
6

7.  Un espectro de absorción es una
representación gráfica de la
absorbancia de un analito (o de otra
magnitud equivalente) en función de la
longitud de onda de la radiación λ (o de
otro parámetro relacionado con la
energía de la radiación utilizada).
El máximo de absorbancia obtenido
en el espectro de absorción de un
analito, nos dará la longitud de onda
que proporciona la mayor sensibilidad
posible, y por tanto será la que se
utilizará en el análisis
espectrofotométrico de dicho analito.
Espectros de absorción
Absorbancia
A
λ
nm
λm
ax
7
Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

8. •La sensación de color se produce cuando disminuye
apreciablemente una o más zonas de la región visible.
•Si el ojo recibe luz de todas las λ de la región visible el
efecto es luz blanca.
•El color aparente siempre es el color complementario del
que ha sido eliminado.
•Los colores complementarios son útiles para predecir la λ
de absorción de los compuestos coloreados: una
disolución amarilla, absorberá luz azul 450-480 nm, para
analizarla debemos usar luz con esta λ seleccionada con el
monocromador o bien usar un filtro azul, que transmite
esta luz azul
Teoría del color
8
Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

9. • Abarca un intervalo muy
amplio de longitudes de
onda o energías.
• Según su λ recibe
diferentes nombres.
• La luz visible, que es la
única perceptible por el
ojo humano, representa
solamente una pequeña
parte del espectro,
desde 350-380 a 750-
780 nm.
Espectro electromagnético
9

10. amarillo-verde
520 - 550 violeta
380 - 420
amarillo
550 - 580 420 - 440
anaranjado
580 - 620 azul
440 - 470
rojo
620 - 680 verde-azul
470 - 500
púrpura
680 - 780 verde
500 - 520
verde
500 - 520 púrpura
680 - 780
verde-azul
470 - 500 rojo
620 - 680
azul
440 - 470 anaranjado
580 - 620
azul-violeta
420 - 440 amarillo
550 - 580
violeta
380-420 amarillo-verde
520 - 550
Color absorbido
λ (nm)
complementario
Color observado
λ (nm)
Una disolución se observa de color azul cuando se ilumina con luz policromática,
porque absorbe λ 580-620 nm (anaranjado) y transmite o deja pasar λ 440-470 nm
(azul)
azul-violeta
10
Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

11. Las longitudes de onda que una molécula puede absorber
dependen de la estructura atómica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, etc), por lo que dicha técnica
constituye un valioso instrumento para la determinación y
caracterización de biomoléculas.

12. 300 500 700 900
Lámpara de
Deuterio
Lámpara de
Tungsteno o Wolframio
longitud de onda (nm)
intensidad
lumínica
1100
Fuente de energía radiante
Continua. Estable. Intensa
Para λ
en el
Visible
Para λ en el
Ultravioleta
Características
12
Instrumentación

13. Selector de λ
Filtros de corte
Filtros de absorción
Filtros de interferencia
•longitud de onda de máxima transmisión
•ancho de banda efectivo
Características
Monocromadores de prisma
Monocromadores de red
Fotómetros Espectrofotómetros
13
Instrumentación

14. Cubetas
Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo
Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del haz incidente
Características
Vidrio o plástico
Visible
Sílice
Ultravioleta
14
Instrumentación

15. Detectores
•deben responder a un amplio rango de longitudes de onda
•deben dar respuesta rápida
•deben ser sensibles a bajos niveles de radiación
•deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable
•la señal debe ser proporcional a la potencia radiante
Su función es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible.
Características
Fototub
os
Fotomultiplica
dores
Fotodiodoar
ray
15
5. Instrumentación

16. Instrumentación
Componentes básicos de los espectrofotómetros
Fuente de
energía
radiante
Selector
de λ
Detect
or
Dispositivo
de lectura
Cubeta
muestr
a
16
Luz
compuesta
Monocromador
I0
I
b
Luz
monocromátic
a
Fuente de
radiación
Detector
Muestra

17. Material de Espectrofotometría

19. Calibración con patrones de concentración conocida
Analito en la
muestra
A
mues
tra
A
(
=
508
nm
)
19
Aplicaciones analíticas

21. https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU
Principio de Espectrofotometría
Ley de Lambert y Beer
Absorbancia
Transmitancia

22. Curva de Calibración
https://www.youtube.com/watch?v=7AC3uYjDi9Q
Tubo Glucosa Absorbancia
Blanco 0 0
1 4 0.051
2 8 0.167
3 12 0.294
4 16 0.4
5 20 0.532
0
0.051
0.167
0.294
0.4
0.532
y = 0.0274x - 0.0332
R² = 0.9885
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 5 10 15 20 25
Curva de Calibración de Glucosa
Absorbancia
Linear (Absorbancia)

24. G-1

26. G-2

28. G-3

29. C-1