Esta prueba utiliza el azul de metileno como un indicador de óxido-reducción para determinar la calidad sanitaria de la leche midiendo el tiempo que tarda en pasar de azul oxidado a incoloro reducido, lo que es proporcional a la carga microbiana presente. Un tiempo de reducción menor a 5 horas indica una leche de buena calidad.

1. UNIVERSIDAD JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ
CARRIÓN
FACULTAD DE BROMATOLOGÍA Y NUTRICIÓN
MICROBIOLOGÍA
CÓRDOVA BAUTISTA,
SERGIO
IV CICLO

2. • El mecanismo del azul de Metileno para valorar la calidad microbiológica está relacionado
con la actividad reductora de las bacterias que en el proceso de respiración eliminan el
oxígeno disuelto en la leche y el colorante se reduce hasta que se elimina totalmente.
• Si por cualquier causa ese oxigeno es separado, el Eh disminuye. Esto ocurre cuando los
microorganismos crecen en la leche y consume el oxígeno. Si el número de
microorganismos es muy elevado, el consumo de oxigeno será mayor y por consiguiente el
Eh caerá rápidamente: si por el contrario, el número de microorganismo es pequeño, el Eh
disminuirá lentamente.
• Esta prueba nos sirve para la determinación de la calidad sanitaria de la leche, utilizando
como un indicador de óxido-reducción al azul de metileno, este se presenta de color azul
en su forma oxidada y es incoloro en su forma reducida (leucobase).
• El tiempo en horas que tarda en pasar el azul de metileno de su forma oxidada (azul) a la
reducida (incolora) bajo condiciones controladas es proporcional a la calidad sanitaria de
la leche.
• Internacionalmente la tabla de interpretación del TRAM se relaciona con las siguientes
recuentos de bacterias/mL.
TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE
METILENO

3. Esta prueba nos sirve para la determinación
de la calidad sanitaria de la leche,
utilizando como un indicador de óxido-
reducción al azul de metileno, este se
presenta de color azul en su forma oxidada
y es incoloro en su forma reducida
(leucobase).
El tiempo en horas que tarda en pasar el
azul de metileno de su forma oxidada (azul)
a la reducida (incolora) bajo condiciones
controladas es proporcional a la calidad
sanitaria de la leche.
Internacionalmente la tabla de
interpretación del TRAM se relaciona con
las siguientes recuentos de bacterias/mL.

4. 1.1 Objetivos
Determinar el tiempo de reducción del azul de metileno “TRAM” en leche fresca.
Comprender los fundamentos de la medida del tiempo de reducción del azul de
metileno o prueba de la reductada bacteriana en una muestra de leche.
Aplicar el procedimiento experimental de la prueba de la reductasa bacteriana en
el laboratorio.
Interpretar los resultados obtenidos y relacionarlos con la presencia de
microorganismos y la calidad higiénica de la leche.

5. 1.2. Materiales y equipos
• Leche fresca
• Solución de azul de metileno
• Incubadora a 37°C Erlenmeyer
• Pipetas graduadas estériles

6. 1.3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
METODO : reducción del azul metileno
FUNDAMENTO : el método mide en intervalo de tiempo requerido, la decoloración
producto del cambio de estado del colorante azul de metileno (azul estado
oxidado a blanco estado reducido) por acción de actividad microbiana.
La mayoría de los gérmenes de la leche cuando se multiplican elaboran enzimas reductasas
que modifican el potencial de óxido-reducción de la misma. Para demostrar ese fenómeno
basta añadir a la leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a la forma
reducida. La rapidez con que cambia de color está en función de la población bacteriana y,
por ello, puede ser un índice del grado de contaminación de la leche. El colorante más
empleado en la industria láctea para realizar esta prueba es el azul de metileno, pero
también se pueden utilizar la resazurina y el cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que
son colorantes fácilmente absorbibles por las células vivas y se decoloran a una velocidad
proporcional a la actividad de las reductasas microbianas.

7. 1.4. Procedimiento
• Colocar en cada uno de los erlemeyer estériles 5 mL de la solución de azul de
metileno.
• Agregar 50 ml de leche fresca con pipeta o medidor estéril. Rotular.
• Mezclar el contenido de los erlenmeyer mediante rotación, hasta obtener perfecta
distribución del colorante y la leche.
• Incubar a 37°C junto con un erlenmeyer patrón (leche sin indicador).

8. • Contar el tiempo de reducción (decoloración) y observar su color
frecuentemente durante la primera media hora, sin agitarlos. Una muestra se
considera reducida cuando presenta 4/5 decolorada.
• Si la muestra se decolora durante un periodo de incubación de 30 minutos,
registrar el resultado “tiempo de reducción 30 minutos”. Seguidamente pueden
observarse el color de los tubos e intervalos de 1 hora, pero se registran los
resultados en horas enteras: así por ejemplo: si a las 2½ horas se observa la
decoloración, el resultado se registra “tiempo de reducción den 2 horas”.

9. 1.5. CLASES DE LECHES SEGÚN LA REDUCCIÓN
DEL AZUL DE METILENO

10. 1.6. Resultados
Muestra Tiempo de reducción Calificación
1 <5 hrs buena
2 <5 hrs buena
3 <5 hrs buena
4 <5 hrs buena
Tiempo de reducción del azul de metileno en muestras de leche fresca

11. 1.7. Interpretación de los resultados
• La presencia de microorganismos en la leche y por su acción reductora, se
produce una modificación del color del azul de metileno, pasando de color
azul intenso a azul claro, pudiendo desaparece totalmente de acurdo a la
carga microbiana presente. Una leche con un contenido bajo en
microorganismos, no modifica el tinte azul del colorante o tarda mucho
tiempo en modificarlo. Se pueden calcular aproximadamente los resultados
de la prueba del azul de metileno

12. 1.8. Conclusión
• A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el método
para la realización de la prueba de la decoloración del colorante
azul de metileno o prueba de la reductasa bacteriana. Esta prueba
resulta muy útil a la hora en la industria láctea puesto que la
velocidad a la que se produce el cambio de color del indicador
azul de metileno es directamente proporcional al número de
gérmenes presentes. De esta manera se puede determinar de
manera indirecta la calidad higiénica de la leche.

13. 1.9. Bibliografía
• Boletín Oficial de Estado (BOE). Disponible en:
http://www.boe.es/
• Normas de Higiene para el Sector Lácteo. Control de industrias
lácteas y grasas comestibles. Ed. Instituto de Salud Pública.
Dirección General de Salud Pública y Alimentación. Madrid. 2007.