laboratory of genetic

1. UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO
División de ciencias naturales y exactas
Laboratorio de genética
Reporte 5:
Reproducción meiotica en levaduras convencionales y
análisis genético de la segregación meiotica
EQUIPO #4:
Guzmán Barrón Michelle Montserrat
Velázquez Villafaña Marion
12 de abril del 2014

2. Introducción:
Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado
industrialmente en la fabricación de pan, cerveza
y vino.
Las fuentes de carbono utilizadas por las
levaduras varían desde los carbohidratos hasta los
aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar
ciertos tipos de azúcares ha sido tradicionalmente
empleada para la caracterización de las distintas
razas que esta especie presenta. Uno de los
azúcares que no puede metabolizar es la lactosa.
Las levaduras, además de necesitar una fuente de
carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno —
como podrían ser el amonio, la urea o distintos
tipos de aminoácidos— como fuentes de fósforo.
Además, son necesarias vitaminas como la
Biotina, también llamada Vitamina H.
El apareamiento sexual sólo puede ocurrir entre células haploides de distinto sexo, las
células a y las células alfa. En el
caso de las levaduras, la
determinación sexual no se debe a
un cromosoma distinto entre sexos
sino más bien a una diferencia en
un único locus. Dicho locus se
conoce con el nombre de MAT.
Las células haploides de cualquiera
de los sexos responden a la
feromona producida por el sexo
contrario. Las células de sexo
opuesto podrán fusionarse,
formando una célula diploide. Las
células haploides nunca podrán
realizar la meiosis en condiciones
normales. Por el contrario, las células diploides no producen ni responden a ninguno de los
dos tipos de feromonas, pero sí pueden realizar meiosis bajo condiciones ambientales muy
determinadas.
Una levadura haploide es capaz de cambiar de sexo.
Las levaduras poseen copias del locus MAT que están silenciadas y por tanto no interfieren
en la determinación sexual. Cuando se produce un cambio en el sexo de las levaduras, se
produce un reemplazamiento génico del locus MAT por una de las copias adicionales.
Las cepas de levaduras utilizadas en los laboratorios no suelen realizar este cambio de sexo
debido a que están alteradas en el gen HO, que es determinante para el cambio de sexo.
El genoma de esta levadura contiene aproximadamente 12.156.677 pares de bases, Está
organizado en un conjunto de dieciséis cromosomas completamente caracterizados. Se
estima que comparte aproximadamente el 23% del genoma con el ser humano.

3. Objetivos:
 Identificar las distintas fases de del ciclo sexual en S. cerevisiae.
 Identificar a la progenie recombinante y en base a la segregación de los diferentes
caracteres genéticos corroborar su ubicación en un cromosoma específico
Metodología:
PARTE 1
1. Realiza un parche de las 2 cepas Y1 y Y7 de aproximadamente 1cm2
2. Incuba 4 días y transfiere a medio de pre-esporulación incubando 5 días.
3. Transfiere finalmente a medio de esporulación e incuba 1 semana.
4. Identifica al microscopio las ascas formadas, producto de la meiosis.
Guarda a 4 °C las ascosporas para realizar análisis de segregación meiótica mediante análisis
en masa.
PARTE 2:
Tomar una porción de las células esporulantes que provienen del cruce Y1 X Y7 con un
palillo estéril y suspenderlas en 0.2 ml de glusulasa diluida 1:40. Incubar 1 h a 30 C.
1. Añadir 0.1 m l aproximadamente de perlas de vidrio e incubar 1 h mas. Añadir
1 ml de agua estéril y agitar en el vortex 1 min y añadir 4 ml de de agua estéril.
Mezclar
2. Preparar diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar 100 L de las diluciones 10-2 y
10-3 en medio YPD.
3. Incubar hasta el viernes por la tarde y rescatar las colonias ROSAS
sembrándolas con el palillo en los medios
Resultados:
Imagen 1. Observacion de las tetradas
En la imagen de las que se observaron en las placan solo en la tercer caja, se observaron
mas,por lo que de esa caja,se tomo la muestra para hacerlas diluciones 10-1,10-2 y 10-3.

4. Colonia MM MMCom-
pleto
MM-ade MM-his MM-leu MM-Ura
1 -  - - - -
2 -  - -  
3 -  - -  
4 -  -   
5 -  - - - 
6 -  - - - -
7 -  - - - -
8      
9 -  -  - 
10 -    - 
11      
12 - + - - + -
13 - + - - - -
14 - + - - - -
15 - + - - - -
16 - + - - + +
17 - + - - + -
18 - + - + - -
19 - + - + - -
20 - + - + - -
21 - + - - - -
22 - + - + - +
23 - + - - - +
24 - + - - + -
25 - + - + + +
26 + + - + + +
27 - + - - + +
28 - + - + + +
29 + + - - - -
30 - + + + - -
31 - + - + + +
32 - + - - - -
33 - + - - - -
34 - + - - - -
35 - + - + - -
36 - + - - - -
37 - + - - - +
38 - + - - - -
39 - + - - - +
40 + + - - - +
41 - + + - + +
42 - + + - + +

5. 43 + + - - + -
44 + + - - - +
45 - + - - - +
46 + + + + + +
47 - - + + - -
48 + + + + + +
49 + + + - + +
50 + + + + + +
51 - + + - + +
52 - - - + - -
53 - - + + - +
54 + + + - + +
55 - - + + - +
Nota: crecimiento –sin crecimiento
Tabla 1. Crecimiento de las colonias en los diferentes medios de cultivo
Colonia Fenotipo Genotipo Parental o Recombinante
1 A: leucina,
adenina, uracilo
e histidina
-leu - ade - ura - his Recombinante
2 A: leucina,
adenina
P:uracilo,
histidina
-leu –ade ura  his Recombinante
3 A: leucina,
adenina
P:uracilo,
histidina
-leu –ade ura  his Recombinante
4 A: leucina
P: adenina,
uracilo e
histidina
-leu  ade  ura  his Recombinante
5 A: leucina,
adenina, uracilo
P:histidina
-leu - ade - ura  his Recombinante
6 A: leucina,
adenina, uracilo
e histidina
-leu - ade - ura - his Recombinante
7 A: leucina,
adenina, uracilo
e histidina
-leu - ade - ura - his Recombinante

6. 8 P: leucina,
adenina, uracilo
e histidina
leu  ade  ura  his Recombinante
9 A: leucina,
uracilo
P:adenina,
histidina
-leu  ade - ura  his Recombinante
10 A:uracilo
P:leucina,
adenina e
histidina
leu  ade - ura  his Recombinante
11 P: leucina,
adenina, uracilo
e histidina
leu  ade  ura  his Recombinante
12 A:adenina,
histidina
P:leucina,uracilo
+leu –ade +ura -his Recombinante
13 A: leucina,
adenina, uracilo,
histidina
-leu -ade -ura -his Recombinante
14 A:leucina,
Adenina, uracilo,
histidina
-leu –ade –ura -his Recombinante
15 A:leucina,
adenina,
uracilo,histidina
-leu –ade –ura –his Recombinante
16 A:adenina,
histidina
P:leucina,uracilo
+leu –ade +ura- his Recombinante
17 A:adenina,
histidina, uracilo
P:leucina
+leu –ade -ura -his Recombinante
18 A:adenina,
leucina, uracilo
P:histidina
-leu –ade –ura +his Recombinante
19 A:adenina,
leucina, uracilo
P:histidina
-leu –ade –ura +his Recombinante
20 A:adenina,
leucina, uracilo
P:histidina
-leu –ade –ura +his Recombinante

7. 21 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante
22 A:adenina,
leucina
P:histidina,
uracilo
-leu –ade +ura+his Recombinante
23 A:adenina,
histidina, leucina
P:uracilo
-leu –ade +ura -his Recombinante
24 A:adenina,
histidina, uracilo
P:leucina
+leu –ade –ura-his Recombinante
25 A:adenina,
uracilo
P:leucina,
histidina
+leu –ade –ura +his Recombinante
26 A:adenina
P:leucina,
histidina ,uracilo
+leu –ade +ura +his Recombinante
27 A:adenina,
histidina
P:leucina, uracilo
+leu –ade +ura –his Recombinante
28 A:adenina
P:leucina,
histidina, uracilo
+leu –ade +ura +his Recombinante
29 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante
30 A:leucina, uracilo
P:adenina,
histidina
-leu +ade –ura +his Recombinante
31 A:adenina
P:histidina,
leucina, uracilo
+leu –ade +ura +his Recombinante
32 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante
33 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante

8. 34 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante
35 A:adenina,
leucina, uracilo
P:histidina
-leu –ade –ura +his Recombinante
36 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade -ura -his Recombinante
37 A:adenina,
histidina, leucina
P:uracilo
-leu –ade +ura –his Recombinante
38 A:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
-leu –ade –ura –his Recombinante
39 A:adenina,
leucina, histidina
P:uracilo
-leu –ade +ura – his Recombinante
40 A:adenina,
leucina, histidina
P:uracilo
-leu –ade +ura –his Recombinante
41 A:histidina
P:adenina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura –his Recombinante
42 A:histidina
P:adenina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura –his Recombinante
43 A:adenina,
histidina, uracilo
P:leucina
+leu –ade –ura –his Recombinante
44 A:adenina,
histidina, leucina
P:uracilo
-leu –ade +ura –his Recombinante
45 A:adenina,
histidina, leucina
P:uracilo
-leu –ade +ura –his Recombinante
46 P:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura +his Recombinante
47 A:leucina, uracilo
P:adenina,
histidina
-leu +ade –ura +his Recombinante

9. 48
P:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura +his Recombinante
49 A:histidina
P:adenina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura –his Recombinante
50 P:adenina,
histidina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura +his Recombinante
51 A:histidina
P:adenina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura –his Recombinante
52 A:adenina,
leucina, uracilo
P:histidina
-leu –ade –ura +his Recombinante
53 A:leucina
P:adenina,
histidina, uracilo
-leu +ade +ura +his Recombinante
54 A:histidina
P:adenina,
leucina, uracilo
+leu +ade +ura –his Recombinante
55 A:leucina
P:adenina,
histidina, uracilo
-leu +ade +ura +his Recombinante
Nota: A = Auxotrofo P = Prototrofo
Tabla 2. Determinación de Fenotipo y Genotipo e identificación de recombinantes
Tipo Genotipo Número de
individuos
con este
genotipo
I -leu - ade - ura – his 13
II -leu –ade ura  his 3
III -leu  ade  ura  his 3
IV -leu - ade - ura  his 1
V leu  ade  ura  his 5
VI -leu  ade - ura  his 5

10. VII leu  ade - ura  his 2
VIII -leu –ade +ura -his 5
IX +leu-ade +ura -his 4
X +leu –ade –ura -his 2
XI +leu –ade +ura +his 3
XII +leu +ade +ura -his 2
XIII -leu +ade –ura +his 3
XIV +leu +ade +ura -his 3
XV +leu +ade +ura -his 1
Tabla 3. Tipos de recombinantes y su frecuencia
Discusión de resultados:
Después de realizar la cruza se obtuvieron los diploides, algo que hay que tomar en cuenta al
momento de visualizarlos en el microscopio es tu tridimensionalidad, la limitación del microscopio
para mostrarnos únicamente dos dimensiones podría confundir en algún momento al observador
en el momento de analizar las ascas.
Una vez que se obtuvieron eso se analizaron cepas cuya coloración era rosa ya que eso
garantizaba la auxotrofia a adenina (debido a que la coloración es producida por un metabolito de
la síntesis de adenina que al no poder seguir con su ruta se estanca y produce la coloración) y
posteriormente vimos toda la segregación identificando el genotipo de cada una de las colonias
que logramos aislar, con esto queda demostrado como afecta la segregación meiotica a la
variabilidad de un organismo además de cómo se pueden llegar a complementar ciertas
auxotrofias.
También tomamos en cuenta 10 cepas de las colonias blancas que se resembraron,
para obtener las combinaciones posibles y estas están marcadas de color rojo en la tabla de
resultados.
Conclusión:
Se determinaron las características de Saccharomyces cerevisiae , se compararon las diferencias
anatómicas entre ambas cepas originales, se identificaron cepas recombinantes con una
auxofrofia a adenina, mediante las originales con características similares otorgadas por la
maestra dentro del laboratorio. Se logró diferenciar las cepas recombinantes y sus auxofrofia y
Prototrofia con éxito para cada una de las cepas obtenidas.
Por lo que se podría concluir de forma general que un microorganismo es auxótrofo cuando sólo
es capaz de proliferar en un medio de cultivo si a éste se ha añadido alguna sustancia específica,
que el tipo silvestre, llamado protótrofo, no requiere, porque es capaz de sintetizarla.

11. También que Típicamente, la genética subyacente a una auxotrofia es la carencia de una ruta
metabólica funcional que genere la sustancia de la que depende el auxótrofo y que esta carencia
suele deberse a una mutación que genera un alelo nulo carente de capacidad biológica.
Cuestionario:
1. Que harías para demostrar si cada una de ellas heredó una tercera o cuarta mutación ura-
leu- y/o his- . Por ejemplo, ¿como saber que las cepas ade- y ura- solo llevan esta dos
mutaciones o también son leu- y/o his-?
R= se sembraron en todos los medios ya mencionados lo cual nos permitió identificar todas
las auxotrofias presentes ya sea que concordaras con las que ya tenían como consecuencia
de los parentales o debido a la segregación al formarse los recombinantes
2. ¿Cual de las combinaciones de la tabla es la más abundante? ¿y que explicación genética le
dan?
R= el primer tipo de recombinante mencionado es el más abundante, esto se atribuye a la
distancia de los genes en cuestión que se estudiaron, las siguientes imágenes muestran la
localización de los genes ura3 leu2 his1 en el caso de la auxotrofia en adenina no sabemos
cuál gen requerido para la síntesis de adenina está dañado.
Ura 3
Leu2
His 1
Conclusión:
Se identificaron las distintas fases del ciclo sexual en S. cerevisiae al ver paso a paso la manera en
que dicho proceso se lleva a cabo, además se identifico la progenie recombinante observando el

12. crecimiento en distintos medios identificando así las auxotrofias y posteriormente el genotipo el
cual después de compararlo con el genotipo parental nos indico cuales eran recombinantes , una
vez hecho eso se estudio cómo afecta la ubicación y la distancia entre los genes involucrados a la
formación de recombinantes.
Aplicación
Saccharomyces cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas
biológicos.
Las aplicaciones industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza,
pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso
de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra
en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de
nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor
rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación.
Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple
de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su
velocidad de división celular (aproximadamente dos horas).
Bibliografía:
http://es-urug.finanzalarm.com/details/Saccharomyces_cerevisiae.html
http://www.yeastgenome.org