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Práctica de laboratorio pcr

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Práctica de laboratorio pcr

  1. 1. Nombre: Nancy Pulido Soler Email Personal: nanhary81@yahoo.es Estudiante Especialización En Biotecnología Agraria: UNAD - CEAD TUNJA Profesión: Lic. En ciencias Naturales y Educación ambiental. UPTC BIOTECNOLOGIA APORTES TRABAJO COLABORATIVO RESUMEN La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es considerada una técnica biotecnológica cuya finalidad es la amplificación o reproducción in vitro de un número de copias de una región específica de ADN, en este caso bacteriano, para su respectiva evaluación. Que cobra gran valor e importancia debido a sus aplicaciones . SUMMARY Chain reaction (PCR) is considered a biotechnological technique whose purpose is the in vitro amplification or reproduction of a number of copies of a specific region of DNA, in this case bacterial for its evaluation. That is of great value and importance due to their applications. INTRODUCCION Los ribosomas son las estructuras celulares encargadas de la síntesis de proteínas y en su composición se encuentran tanto proteínas como distintas moléculas de ARN conocidas como ARN ribosómico (rARN) se distinguen por su tamaño que se traduce en diferentes velocidades de sedimentación cuando se ultracentrifugan. Así, los ribosomas de procariotas contienen tres rARN, denominados 5S, 16S 7 23S, mientras que los de eucariota poseen cuatro rARN diferentes Los ribosomas son las estructuras celulares encargadas de la síntesis de proteínas y en su composición. Así, los ribosomas de procariotas contienen tres rARN, denominados 5S, 16S 7 23S, mientras que los de eucariota poseen cuatro rARN diferentes. Actualmente se está utilizando una herramienta biotecnológica de gran importancia. PCR, que es una técnica de biología molecular descrita y desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuando trabajaba en la compañía CETUS. Cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN y
  2. 2. ADNc (ADN complementario) particular, partiendo de un mínimo de ADN; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original o molde. JUSTIFICACION Debido a la técnica PCR es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la biología molecular, la biotecnología, la genética, la epidemiología, las ciencias forestales, las ciencias forenses, la microbiología, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, diagnóstico de virus, parásitos, bacterias de difícil cultivo. Es importante que sé que se apliquen dichas técnicas y a que ofrece un diagnóstico confiable y rápido. MARCO TEORICO LA TECNICA DE PCR Hacer una aproximación a la molécula 16S del ARN ribosomal, implica remontarse un poco en el próximo pasado en que el trabajo científico realizado por Carl Woese Richard, permitió establecer claras diferencias estructurales de los organismos procariotas. El dominio Eukarya agrupa, según esta clasificación a los restantes reinos de organismos eucariotas. El dominio Eucarya se caracteriza por tener células eucariotas, los lípidos de sus membranas celulares son, predominantemente, diésteres de acilos grasos de glicerol y sus ribosomas contienen rARN de tipo eucariota. El dominio Bacteria, además de células procariotas, tiene membranas con lípidos del tipo diésteres de glicerol y ribosomas con rARN de tipo bacteriano, mientras que las Arqueas se diferencian de las bacterias tanto en el tipo de rARN de sus ribosomas como en los lípidos de sus membranas, principalmente diésteres de glicerol isoprenoide o tetraéteres de diglicerol, (Margulis, 2002). Los trabajos de Woese se basaron en la comparación de algunas propiedades estructurales de los rARN 16S y 18S que forman parte de la subunidad pequeña de los ribosomas en organismos procariotas y eucariotas respectivamente; luego su trabajo se amplió con el análisis de la secuencia de nucleótidos de los genes que los codifican. El ARNr 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas especialmente; este ARN 16S se encuentra en todos los organismos, desde las bacterias hasta los humanos y su estabilidad estructural y bioquímica a o largo de los milenios ha permitido determinaciones precisas de las distancias filigenéticas entre diversos microorganismos comparados. La comparación de las secuencias del gen 16S rRNA permite la diferenciación entre organismos a nivel de género en todos los phyla principales
  3. 3. de bacterias, además de clasificar las cepas en múltiples niveles, incluyendo lo que hoy se conoce como especie y el nivel de subespecie. El gen rARN 16S se puede comparar no solo entre las bacterias, sino también con el gen de rARN 16S de arqueobacterias y el gen de rARN 18S de eucariotas. Así, se tiene que la precisión de los análisis depende fuertemente de la elección de los cebadores, conocidos también como primers que son promotores híbridos en que la polimerasa se une a una secuencia del promotor que normalmente está delante de la secuencia que especifica el ARN; el primer nucleótido que está en el ARN (incluyendo el promotor) es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, delante – detrás +. El resto del promotor no se transcribe. Se diseñó un promotor artificial combinando la región 35 del promotor Trp y la -10 del promotor Lac, al cual se le dio el nombre de promotor Tac, este promotor resultó ser 5 veces más potente que el Trp y 10 veces más que el de Lac; con el advenimiento de tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, la secuenciación directa de los amplicones de PCR se hizo factible; una primera tecnología de alto rendimiento de secuenciación fue aplicado con éxito para el análisis a gran escala de la biodiversidad y fue clave para el descubrimiento de la “biósfera rara”. El uso de primers subóptimos, o precisamente pares de iniciadores, pueden llevar a una representación o de la selección frente a especies individuales o incluso grupos enteros a conclusiones biológicas dudosas (Kildworth, 2012). La secuencia de los oligonucleótidos que servirán de cebadores es uno de los parámetros importantes a considerar en el diseño de una reacción de PCR, dada la alta sensibilidad de la técnica de la PCR, ésta es muy susceptible de contaminación con ADN exógeno que pueda ser amplificado, éste puede provenir de ADN generado en amplificaciones previas por PCR, incorrecta manipulación de las muestras, reactivos contaminados con ADN, etc, es recomendable siempre incluir una reacción sin ADN como control negativo. Entre las precauciones a seguir, a fin de evitar contaminación se puede separar las áreas de preparación de las muestras (pre PCR) y de análisis de los productos de la reacción (post PCR), esterilizar todas las soluciones y el material utilizado (Maldonado, 1996).
  4. 4. Práctica de laboratorio PCR realizada en la materia de biología molecular laboratorio UNAD 2013:
  5. 5. Fig 3. Se observa en esta figura la secuencia del gen de electroforesis, en las seis bandas utilizadas en este trabajo; de izquierda a derecha, las secuencias 1, 3, 4 y 6 de acuerdo con la descripción de los resultados obtenidos corrieron como se esperaba; la secuencia 2 no corrió como se esperaba y la secuencia 5 no evidenció presencia alguna.
  6. 6. Fig 4.
  7. 7. Fig.6 Fig 5. Fig 7. VIDEOS REALCIONADOS CON LA TECNICA DE PCR 1. ¿Qué es un PCR? Contenido del video: Que es el PCR. Etapas. Utilidad. Enlace: http://www.youtube.com/watch?feature=endscreen&v=o51jyCH_4fU&NR=1 http://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E 2. APLICACIONES DE LA TECNICA DE PCR Contenido del video:
  8. 8. Biotecnología actual aplicaciones agrícolas y ganaderas http://www.youtube.com/watch?v=pn76dqS3Csc En microbiología: 3. GENETICA Y PCR Enlace: http://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E CONCLUSIONES La técnica PCR es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la biología molecular, la biotecnología, la genética, la epidemiología, las ciencias forestales, las ciencias forenses, la microbiología, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, diagnóstico de virus, parásitos, bacterias de difícil cultivo . Es significativo que sé que se apliquen dicha técnicas y a que ofrece un diagnóstico confiable y rápido. Es importe tener en cuenta que cuando se valla a utilizar PCR la secuencia de oligonucleótidos que se usará como cebador es uno de los parámetros más importantes debido a su alta sensibilidad y a que puede ser muy susceptible a contaminarse , por eso es importante tener un ADN de control negativo para controlar esta variable, se deben separar las áreas de las muestras pre PCR ,los productos de la reacción post PCR ,las soluciones y esterilizar los materiales. BIBLIOGRAFIA SECUENCIAS DE ADN RIBOSOMAL 16S EN MUESTRAS BACTERIANAS UTILIZANDO LA TÉCNICA DE PCR. Riaño Rojas Laura María, Quintero Ruiz Ludy Marcela, Pulido Soler Nancy, Fonseca Millán Arnulfo, Ríos Ortiz Héctor Fabio. Universidad Nacional Abierta y a Distancia. UNAD. Escuela de Ciencias Agrícolas Pecuarias y del Medio Ambiente EMCAPA.
  9. 9. MALDONADO, Eneida. Biología Molecular en Medicina. Ed: Limusa, S.A. de CV. México D.F. 1996. KLINDWORTH, Anna., PRUESSE, Elmer., SCHWERR, Timmy., PEPLIES, Cristian., HORN, Mathias., GLOCKNER, Frank O. Evaluación de los Genes 16S Ribosomal RNA Genes Primers de PCR para Estudios de Diversidad Clásicos y de Nueva Generación Basada en la Secuenciación. Oxford Journals. Nucleic Acids Research. 31/10/2012

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