3. Principios Fundamentales
Las pruebas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) son una forma
rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y
cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno (el
organismo que causa una enfermedad) o células anormales en una muestra.
Las metodologías basadas en determinación de ADN son específicas y sensibles,
especialmente la técnica de q-PCR. Algunos sistemas utilizan "agentes
intercaladores fluorescentes" de la doble cadena de ADN, sin embargo, existe la
posibilidad de producir falsos positivos si aparecen productos de PCR inespecíficos
o dímeros de cebadores (Costa, 2004).
4. Los sistemas que emplean diversos tipos de sondas fluorescentes (Taqman®, «molecular
beacons" y "scorpions") poseen la ventaja de hibridar únicamenteen la secuencia del
ADN diana. Particularmente, la sonda Taqman® es un oligonucleótido con fluorocromos
en los dos extremos que hibrida en regiones internas y específicas de los productos de
PCR (Didenko, 2001).
5. La PCR es una técnica utilizada en biotecnología para amplificar fragmentos de ADN
específicos para diversos fines. La sonda y el cebador son dos tipos de
oligonucleótidos monocatenarios utilizados en varios tipos de PCR. Las sondas se usan
principalmente en qPCR, mientras que los cebadores sintéticos se usan en cada tipo
de PCR. La principal diferencia entre la sonda y el cebador es que la sonda se usa para
detectar la presencia de un fragmento de ADN específico en la mezcla a través de la
hibridación con un ADN bicatenario, mientras que el cebador se usa en el inicio de la
reacción en cadena de la polimerasa por hibridación. con ADN monocatenario . En
general, los cebadores se usan en el inicio de la replicación del ADN dentro de la
célula. Las sondas también se usan en reacciones de hibridación.
6. ¿Como es el proceso de la técnica de qPCR?
Tomar una muestra de sangre, saliva, moco o tejido
La muestra tiene su propio ADN y posiblemente el ADN de un patógeno o de una célula
cancerosa
La muestra se introduce en una máquina especial. Se añade una enzima llamada polimerasa a la
muestra. Esto hace que la muestra produzca copias
El proceso de copia se repite varias veces. Después de una hora, se hacen miles de millones de
copias. Si hay un virus o un agente patógeno, eso se indica en la máquina
7. Ventajas de una PCR en tiempo real
• Sensibilidad
Cuantificación
Monitoreo de todo el procedimiento
Disminución del riesgo de contaminación
Automatización
Amplicones pequeños
Amplio rango dinámico
Transcripción reversa
8. Limitaciones de una PCR en tiempo real
• Longitud amplicón 50-150 pb
• Necesidad de 3 regiones conservadas (2 cebadores + sonda)
• Tm cebadores menor que la Tm de la sonda
• Restricción en la secuencia y contenido de GC de algunos tipos de sondas para no inhibir el
reporter
• Aparato de PCR a tiempo real
• Coste mayor (sonda y reactivos)
9. Ensayo de qPCR en tiempo real y su investigación científica
Todos hemos oído hablar mucho últimamente de la PCR, ya que esta técnica de
análisis ha estado en el punto de mira por su necesidad en las pruebas de
diagnóstico de COVID-19. Ahora, muchos de nosotros pronunciamos este término,
reservado principalmente a los científicos (en concreto a los biólogos) como si todos
supiéramos exactamente lo que es. Pero, ¿qué es realmente la PCR? PCR son las
siglas en inglés de Reacción en Cadena de la Polimerasa, una técnica de laboratorio
que se utiliza para copiar rápidamente un segmento de ADN. Esta técnica permite a
los científicos tomar un fragmento muy pequeño de secuencias de ADN y amplificarlo
hasta obtener una cantidad lo suficientemente grande como para poder estudiarlo en
detalle en un segundo paso.
Esta técnica se utiliza para el diagnóstico médico rápido de enfermedades como el
COVID-19, así como de la tuberculosis y otras infecciones, y también ha pasado a
ser habitual en la investigación biomédica y criminalística.
10. Aplicaciones de la PCR en tiempo real en microbiología
• La PCR a tiempo real combinada con los nuevos sistemas automáticos para la purificación de ácidos nucleicos, ofrece
una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y
cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico. Debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de
empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de contaminación, la PCR a tiempo real, irá reemplazando la PCR
convencional y se extenderá a un amplio abanico de aplicaciones microbiológicas.1
• Los ensayos basados en PCR se utilizan actualmente de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios de
microbiología. Pero, con pocas excepciones, están restringidos al campo de la virología, especialmente a un número
limitado de objetivos virales con un interés económico importante para los cuales están disponibles ensayos
comercialmente bien estandarizados. 2
• Por varias razones, ha tenido una implementación deficiente de los ensayos de PCR en el diagnóstico de rutina para
otras enfermedades infecciosas a pesar de que son ventajosos. En combinación con el aislamiento automatizado de
muestras de ácidos nucleicos, la PCR en tiempo real ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de ensayos
moleculares para una amplia gama de agentes infecciosos de interés clínico. Por sus ventajas, como sencillez, rapidez y
menor riesgo de contaminación.3
11. Bibliografías
• Barrera Cubillos, G. P., Murcia, J., Cerón Pérez, J. L., Cuartas Otálora, P. E., Guzmán Santofimio, C. A., & Villamizar, L. F. (2016). PCR en
tiempo real: una metodología útil para la detección y cuantificación de granulovirus. Revista colombiana de biotecnologia, 18(2), 24.
https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61514
• Pruebas de PCR. (s/f). Medlineplus.gov. Recuperado el 30 de junio de 2023, de https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-
laboratorio/pruebas-de-pcr/
• Nova, P. J. (2022). Desventajas de la PCR a tiempo real respecto a la. León.
• Costa, J. (2004). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 22(5), 229-305.
• MC, L. (204). sciencedirect. Obtenido de https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0213005X0473092X
