Este documento presenta las instrucciones para una práctica de biología sobre el uso de una cámara de Neubauer para medir el volumen y calcular la concentración de células en una suspensión. Explica cómo cargar la muestra en la cámara, contar las células en los cuadrantes, y usar esos recuentos para determinar el número de células por mililitro y el número total de células en la suspensión original. Incluye dos ejercicios de práctica para que los estudiantes apliquen los

1. FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y FISIOLÓGICAS
Curso: Biología I
Práctica # 5
Microscopia: Mediciones con el microscopio compuesto de campo claro: Volumen
Autores de la guía: Dra. Margarita Arana, Dr. Oswaldo Ramírez
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA:
Calcular la concentración de células en suspensión utilizando la cámara de Neubauer.
I. Midiendo volumen. Uso del hemocitómetro o cámara de Neubauer.
Materiales
Microscopio de luz
Cámara de Neubauer (hemocitómetro)
Suspensión de células (levaduras)
Pipeta Pasteur
Procedimiento
1) La muestra a contar será una dilución (entre 1/10 a 1/1000) a partir de una suspensión de células.
2) Tome un hemocitómetro y póngalo sobre la mesa. Coloque un cubreobjetos sobre el centro de la cámara.
3) Use una pipeta Pasteur (o un gotero) para transferir una pequeña gota de la dilución al hemocitómetro. Coloque la punta de la pipeta en el canal en forma de V del hemocitómetro (en caso no tenga la ranura, coloque la punta de la pipeta al borde de la lámina cubreobjetos) y permita que la suspensión fluya hacia la cámara por capilaridad hasta que ésta se llene. No sobrellene (Fig. 1)
4) Agregue una muestra similar al lado opuesto de la cámara y deje que las células sedimenten por un minuto antes de empezar a contar.
5) Cada cuadrante del hemocitómetro representa un volumen total de 0.1 mm3 ó 10-4 cm3 (Fig. 2).
Figura 1. Cargando la cámara
Neubauer con muestra.

2. Un cm3 es equivalente a 1ml y 0.1 mm3 es igual a 10-4 ml por lo que la concentración de células por ml y el número total de células puede determinarse usando los siguientes cálculos:
N° Células / ml = promedio contado por cuadrante x factor de dilución x 104
N° Células totales = N° Células / ml x volumen de la suspensión de células
Un (1) Mililitro = 1000 milímetros cúbicos (mm 3) = Un (1) centímetro cúbico (cm3)
Un (1) Microlitro (μl) = Un (1) milímetro cúbico (mm3)
Para que sea válido estadísticamente, la cuenta por cuadrante debe ser aproximadamente entre 10 y 100 células. Si la cuenta es superior, limpie el hemocitómetro y empiece nuevamente pero con la muestra más diluida. El rango de concentraciones que permite contar el hemocitómetro está entre 250.000 células y 2,5 millones de células por ml, siendo el ideal 106 células /ml.
Figura 2. Cámara de Neubauer o hemocitómetro
Figura 3. Ejemplo de criterio para contar: Todas las células que caen sobre el borde izquierdo o el borde superior o sólo lo tocan, sí se cuentan (18 en el ejemplo). Las células que caen sobre el borde inferior o borde derecho o sólo lo tocan, no se cuentan. La figura representa el cuadrante de la esquina izquierda superior del hemocitómetro.

3. Ejercicio #1
Cuente las células en los cuatro cuadrantes de las esquinas de la cuadrícula de hemocitómetro de la figura 4, considerando que se hizo una dilución 1/10 a partir de 10 ml de una suspensión de células. El área de cada cuadrante (que contiene 16 cuadrados de 0.25 mm de lado) es 1 mm2 y el volumen es 0.1 mm3 (1 mm2 de área x 0.1 mm de profundidad). Determine el número de células por ml y el número total de células suspendidas en el tubo inicial y complete la tabla 2.
Figura 4. Cuadrícula de hemocitómetro o cámara de Neubauer
Tabla 1. Conteo de células de la figura 4.
Cuadrante #
Número de células
1
2
3
4
Promedio
N° células/ml en la suspensión inicial de células
N° total de células en el tubo con la suspensión inicial de células
1
2
3
4

4. Ejercicio #2
De manera similar al ejercicio #1, realice ahora el conteo de células en la cámara de Neubauer. Considerando que se hizo una dilución 1/100 a partir de 10 ml de una suspensión original de células, determine el número de células por ml y el número total de células suspendidas en el tubo inicial y complete la tabla 3.
Tabla 2. Conteo de células
Cuadrante #
Número de células
1
2
3
4
Promedio
N° células/ml en la suspensión inicial de células
N° total de células en el tubo con la suspensión inicial de células
Conclusión
Referencias bibliográficas.
1. Bregman, A. (1983). Laboratory Investigations in Cell Biology. John Wiley & Sons. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore.
2. Bastidas Oscar. Conteo Celular con Hematocitómetro. Uso Elemental del Hematocitómetro. Technical notes. www.celeromics.com
Enlaces internet recomendados para revisar antes de la práctica:
Heidcamp, W. Cell Biology Laboratory Manual. http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt1/ex1-6.html
Bikandi, J., San Millán, R., Rementeria, A., and Garaizar, J. 2004. In silico analysis of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR, and endonuclease restriction. Bioinformatics 20:798-9. DOI: 10.1093/bioinformatics/btg491
http://insilico.ehu.es/camara_recuento/
BioyNano Tecnoparque.
http://www.youtube.com/watch?v=AzQywzHjXvA