Inmunoelectrotransferencia

1. INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING

2. Objetivo
➢ Conocer y llevar a cabo la técnica de
inmunoelectrotransferencia

3. Detección en Western Blot
Señal de detección (colorimétrica,
fluorescente o quimioluminiscente)
Sustrato de la enzima
Proteína
Anticuerpo primario
Conjugado enzima-anticuerpo secundario
Membrana de transferencia

4. Aplicaciones

5. Metodología
I. Electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12%
a)Gel separador
b)Gel concentrador
c)Preparación de la muestra e
Klebsiella pneumoniae
d)Tinción con azul de
Coomassie
II. Electrotransferencia
a)Electrotransferencia
b)Tinción con tinta china
c)Tinción con amido negro
d)Tinción con rojo de Ponceau
III.Inmunodetección

6. I. Electroforesis en gel de poliacrilamida
al 12%

7. Gel separador
Reactivos Cámara chica (0.75mm) Cámara grande (1.5mm)
Solución de monómeros 2.3 mL 12.0 mL
Tris 1.5M, pH 8.8 1.5 mL 7.5 mL
SDS 10% 0.12 mL 0.6 mL
Agua 2.0 mL 10.05 mL
Aplicar vacío por 10 minutos
Persulfato de amonio 10% 0.045 mL 0.2 mL
TEMED 0.003 mL 0.018 mL

8. Gel concentrador
Reactivos Cámara chica (0.75mm) Cámara grande (1.5mm)
Solución de monómeros 0.33 mL 1.33 mL
Tris 1.5M, pH 8.8 0.5 mL 2.5 mL
SDS 10% 0.04 mL 0.2 mL
Agua bidestilada 1.22 mL 6.1 mL
Aplicar vacío por 10 minutos
Persulfato de amonio 10% 0.025 mL 0.08 mL
TEMED 0.002 mL 0.09 mL

9. Preparación de la muestra de Escherichia
coli
E. coli (HSP60) en
medio E por 5h
Cosechar
3 lavados
Resuspender
en 250mL reg.
de muestra 2X
15 min

10. 2.5 µL marcadores de peso
molecular en cámara chica,
10 µL en cámara grande
100 µL muestra en
cámara chica, 500 µL
en cámara grande
8 mA hasta
que la
muestra
penetre el gel
separador.
Aumentar a
16 mA

11. Tinción con azul de Coomassie
50 mL de colorante. 1h
Eliminar colorante y agregar decolorante

12. II. Electrotransferencia
1000 mA / 1h
o
175 mA / 18h
* 7 x 7 cm. Poro = 0.45µm

13. Tinción con tinta china
Recortar la tira de la
membrana que contiene los
marcadores de peso
molecular
4 lavados (5 min). 2 mL PBS-T
Cubrir con solución de
tinta china hasta que
se vean las bandas.
Enjuagar con agua
bidestilada 5 min.

14. Tinción con amido negro
5 min en agitación
Lavar 3 veces con PBS-T
Decolorar (sol.
decoloradora) y lavar con
agua

15. Tinción con rojo de Ponceau
Lavar 3 veces con PBS-T 1 - 5 min
Decolorar con agua y secar

16. III. Inmunodetección
1 2 3 4 1 2 3 4
Anti-HSP60
Anti-proteínastotales
Sueronegativo
Reguladordebloqueo
Regulador
de
bloqueo

17. 1 mL de conjugado
peroxidasa-anti-IgG
de ratón
Incubar
Lavados
1 mL de solución
reveladora

19. Resultados
1 2 3 4
1. Suero anti-HSP60
2. Suero anti-proteínas
totales
3. Suero negativo (de
ratón no inmunizado)
4. Regulador de bloqueo