caso cliniko

1. INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
1. Identifique y/o los problemas de salud
ᵌ
Leucocitosis ( 16 000 / mm )
Anemia (9.5 mg / dl)
ᵌ
Trombocitopenia (90 000 / mm ) lo cual trae como consecuencia epistaxis y equimosis.
2. Analice en este problema la relación del desarrollo del los linfocitos B en este trastorno
La leucocitosis se ve reflejada en la acumulación de linfocitos B neoplasicos, ocacionando una
disminución en el desarrollo de la serie mieloide, que salta la vista con la anemia (Hb baja por menor
número de eritrocitos) y trombocitopenia (menor número de plaquetas las cuales causa la epistaxis y
equimosis)
3. Analice en este problema la competencia de los linfocitos B en este trastorno y su respuesta en
la inmunidad adaptativa humoral
El aumento de los linfocitos B neoplásicos se van a infiltrar y activar en los diversos tejidos ocasionando
esplenomegalia, adenomegalia y hepatomegalia. Además la respuesta humoral de los linfocitos B puede
ocasionar una anemia hemolítica autoinmunitaria, ya que las producciones de anticuerpos reconocerán
a los glóbulos rojos como cuerpos extraños.
4. Explique las consecuencias de este trastorno del desarrollo de los linfocitos B
La leucemia linfocítica causa un incremento lento en el número de glóbulos blancos llamados
linfocitos B o células B en la médula ósea. Las células cancerosas se diseminan desde la médula
ósea hasta la sangre y también pueden afectar los ganglios linfáticos y otros órganos como el
hígado y el bazo. Este tipo de leucemia finalmente provoca insuficiencia de la médula ósea,
ocasionando bajos conteos sanguíneos, y debilita el sistema inmunitario.

2. BMP-6 inhibe el crecimiento de células B
maduras humanos; inducción de la
fosforilación y Smad upregulation de Id1
BioMed Central
Christian Kersten (christian.kersten @ sshf.no) [1], Einar A Sivertsen (einar.sivertsen @
labmed.uio.no) [1], Marit E Hystad (mehystad@ulrik.uio.no) [1], Lise Forfang (lise.forfang @
labmed.uio.no) [1], Erlend B Smeland (erlend.smeland @ labmed.uio.no) [1], junio H
Myklebust (junehm@ulrik.uio.no) [1]
[1] Department of Immunology, Institute for Cancer Research, The Norwegian Radium
Hospital, Montebello, 0310 Oslo, Norway
[2] La Facultad División noruega Radium Hospital de la Universidad de Oslo, Noruega
Copyright © 2005 Kersten et al; licenciatario BioMed Central Ltd
Resumen
Antecedentes
Proteína morfogenética de hueso (BMPs) pertenecen a la superfamilia de TGF-β y se
secretan proteínas con funciones pleiotrópicas en muchos diferentes tipos de células. Un
papel potencial de BMP-6 en el sistema inmune ha sido implicado en diversos estudios de
los malignos y las enfermedades reumáticas. En el presente estudio, hemos explorado el
papel de BMP-6 humano normal en la sangre periférica de células B.
Resultados
Las células B se encontraron para expresar BMP tipo I y tipo II y los receptores BMP-6
inducida rápidamente fosforilación de Smad1/5/8. Además, la fosforilación de Smad fue
seguido por upregulation de Id1 mRNA y proteína Id1, Id2 y que Id3 expresión no se vio
afectada. Además, se encontró que BMP-6 tuvo un efecto antiproliferativo en tanto ingenuo
(CD19 + CD27 -) y la memoria de las células B (CD19 + CD27 +) estimulados con anti-IgM
solo o la acción combinada de IgM y anti-CD40L. Además, el BMP-6 induce la muerte
celular en las células B de memoria activada. Es importante destacar que el efecto
antiproliferativo de la BMP-6 en las células B fue completamente neutralizado por el
antagonista natural, noggin. Además, las células B se demostró que upregulate BMP-
6 mRNA a la estimulación con anti-IgM.
Conclusión
En las células B maduras humanos, BMP-6 inhibe el crecimiento celular, y rápidamente
inducida por fosforilación de Smad1/5/8 seguida de un upregulation de Id1.

3. Antecedentes
Los miembros del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) superfamilia teniendo
importancia fundamental en el control de la proliferación celular, la diferenciación, la
migración y la apoptosis [1]. Estas citocinas pueden dividirse en tres subgrupos: TGF-β, la
activinas / inhibins, y las proteínas morfogénica de hueso (BMPs), de los cuales este último
constituyen la familia más grande. 30-38 kDa BMPs son hetero-o homodimeric proteínas
identificadas inicialmente por su capacidad de inducir ectópica de cartílago y la formación
de hueso [2, 3]. Varios estudios han demostrado una función esencial de estas proteínas
durante la embriogénesis, y más recientemente, también en tejidos adultos [1]. TGF-β ha
sido intensamente estudiado, en condiciones normales y malignas de las células
hematopoyéticas y es uno de los más potentes de los reguladores endógenos negativos
conocidos a la fecha. [4]. En cambio, el efecto de BMPs en el sistema inmunitario no ha
sido ampliamente investigado. En ese sentido, BMP-2, -4 y -7 se han encontrado para el
control de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas [5] y principios de
desarrollo de las células T [6, 7]. BMP-6 se ha informado a reducir el número de adoquines
de la zona de formación de las células de las células hematopoyéticas normales humanos
[8]. Por otra parte, BMP-2, -4, 6 y -7 tenido un antiproliferativo y un efecto proapoptótico
sobre el mieloma múltiple las células [9 - 11]. Además, por la expresión de genes de
perfiles, BMP-6 aumentó significativamente el valor predictivo para una firma de varios
genes de prueba y se asoció con un mal resultado en difusas los linfomas de células B
grandes (LBDCG) [12].
BMP-6, al igual que los demás miembros de BMP, y las señales a través de la ligadura de
heterodimerzation BMP tipo I [activin-como-kinasa (ALK)] y del tipo II threonine kinasa
serina-receptores, que posteriormente se propaga la señal abajo por fosforilantes proteínas
Smad. BMP-6 puede señal a través de la ligadura de los receptores tipo I de la Ley RIA,
BMP-RIA, y BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-RII, Ley-RIIA-RIIB y de la Ley, que
llevan a la fosforilación de los receptores Smads (Smad-1, Smad-5, y Smad-8). El R-Smads
entonces forman complejos con el co-Smad (Smad4) y se trasladaron en el núcleo en el
que ejerza la regulación de genes [1, 13].
Dada la función informó de BMP-6 en células B malignas y células progenitoras
hematopoyéticas, quisimos explorar su papel potencial en humanos de células B normales.
Se estudiaron los efectos de BMP-6 en la proliferación y la apoptosis en reposo y
estimulado células B. Además, la expresión de los receptores BMP y BMP-6 inducida por la
activación de la vía de señalización Smad con la consiguiente regulación de los genes
diana Id1-Id4, se resolvieron. Finalmente, se investigó si las células B también son capaces
de producir BMP-6.
Resultados
BMP-6 inhibe inducida por IgM anti-proliferación de las células B
humanos
Los efectos de BMP-6 normales y neoplásicas en células hematopoyéticas, nos llevó a
investigar los efectos de BMP-6 en las células B normales humanos. Todos los

4. experimentos en este estudio fueron realizadas en el marco de suero libre de condiciones
que los FCS se ha demostrado que interfiere con la señalización BMP-[14] (propias
observaciones). Para estudiar el efecto de las BMP-6 en la proliferación, las células B de
voluntarios sanos fueron estimuladas con anti-IgM y / o CD40L en la presencia o ausencia
de BMP-6 durante tres días. Se encontró que BMP-6 condujo a una reducción media del
35% de IgM anti-síntesis de ADN inducida (n = 8; p ≤ 0,0002, Figura 1A]. Se obtuvieron
resultados similares para las células B tratados con anti-IgM y CD40L (26% de reducción
media, n = 6, p ≤ 0.023). El BMP-6 inducida por la inhibición de la proliferación es
dependiente de la dosis en los dos células B periféricas (Figura 1B] y el linfoma de Burkitt
Ramos línea celular (40% de reducción de la síntesis de ADN, la figura1C]. El BMP-6
efectos podrían ser contrarrestados por la adición de un inhibidor extracelular Noggin
(Figura 1D]. Del mismo modo, una combinación de los receptores solubles BMP BMP-RIB-
BMP-Fc y Fc RII-también neutralizar los efectos de BMP-6 (datos no presentados). A
continuación, queríamos probar si BMP-6 tienen diferentes efectos sobre ingenuo y células
B de memoria. Naïve (CD19 + CD27 -) y la memoria (CD19 + CD27 +), células B se aislaron
de sangre periférica de células de la clasificación de immunobead-aisladas células
CD19 + B [15], y la prueba de su capacidad de proliferar en presencia de BMP - 6. Sin
embargo, BMP-6 inhibido IgM anti-síntesis de ADN inducida en las dos subpoblaciones a
una medida similar, con una media de reducción de la síntesis de ADN de 45% (n = 5, p ≤
0.004) para ingenuo células B y 48% (n = 5, p ≤ 0.001) de las células B de memoria
(Figura 1E].
BMP-6 induce la muerte celular en las células B de memoria
humana y células Ramos
A continuación, hemos querido establecer si BMP-6 también podría afectar a la viabilidad
de las células B normales. Viabilidad celular se determinó por yoduro de propidio (PI),
después de la tinción de la cultura, con o sin BMP-6 durante 48 horas. Curiosamente, BMP-
6 mostraron una pequeña pero reproducible aumento medio de la muerte de la célula del
17 al 23% (n = 5, p ≤ 0.003) en estimulado IgM anti-CD27 + células B de memoria. Por otra
parte, Ramos células mostró un incremento medio en la muerte de la célula del 20 al 50%
(n = 3, p <0001, la figura 3] BMP-6 después del tratamiento. En cambio, la muerte de las
células CD19 + del total de células (n = 6, p ≤ 0,32; datos no presentados) o CD27 - IgG -
ingenuo células B no se vio afectada significativamente (n = 5, p ≤ 0,65, la figura 2 ).
Humanos células B expresan receptores BMP-6
El conocimiento detallado acerca de la expresión de diferentes receptores de BMP en
células B no está disponible actualmente. Para aclarar aún más el papel de los BMPs
humanos en las células B, se realizó occidental blot para el tipo I y tipo II receptores BMP.
Este análisis reveló que la Ley de los receptores tipo I-RIA, BMP-RIB y el tipo II de
receptores BMP-IRD y de la Ley de RIIb se expresan en reposo humanos de células B
(Figura 4]. Ramos células expresaron la Ley de los receptores tipo I-RIA, débilmente BMP-
RIB y el tipo II de receptores BMP-IRD, pero más débilmente de lo normal de células B
(Figura 4]. HL60 células fueron utilizados para la comparación y débilmente expresado Ley-
RIA y BMP-RII.

5. En conjunto, estos datos muestran que las células B normales humanos y Ramos células
expresan un conjunto de los receptores BMP, previamente de obligar a BMP-6 [16].
BMP-6 induce la fosforilación de Smad1/5/8
Al vinculante ligando, el receptor transphosphorylates tipo II y tipo I activa el receptor. Tipo I
puede receptores de señales a través de varias vías. Se examinó el efecto de las BMP-6
en la fosforilación Smad, como la activación de Smad se considera como una importante
vía de señalización por BMPs [17]. B células se cultivaron en el suero libre de los medios
de comunicación durante la noche y luego tratadas con BMP-6 para varios tiempos.
Proteínas totales se prepararon lisados, y los importes de las formas de fosforilados
Smad1/5/8 fueron determinados por el oeste blot. Curiosamente, el tratamiento con 500 ng
/ ml BMP-6 induce la fosforilación de Smad. El BMP-6 induce la fosforilación fue elevado a
la mayor brevedad punto a prueba (15 minutos), y se mantuvo alta durante al menos 48
horas (Figura 5]. Una fosforilación similar se observó en células Ramos, pero no en células
HL60 (Figura 6]. Además, la prueba también conocida abajo si otras vías de señalización
de BMP-6 podría ser activado por BMP-6 en las células B humanos. Sin embargo, no
observamos cambios significativos en el nivel de fosfato STAT3 o fosfato p38 a BMP-6
tratamiento de las células B (datos no presentados).
BMP-6 induce upregulation de Id1
A continuación, queríamos explorar si la BMP-6 induce la fosforilación de Smad 1/5/8
también podría inducir cambios transcripcional de genes diana. En este sentido, los
inhibidores de las proteínas de ADN obligatorio (ID) se consideran algunos de los
principales destinatarios de los genes de señalización Smad [17]. Por lo tanto, las células B
se pre-incubaron durante la noche en VIVO X-15, y luego cultivadas en el medio por sí
solas o en presencia de BMP-6 para varios tiempos antes de la preparación del total de
ARN. El importe de Id1-Id4 ARNm se cuantificó en tiempo real RT-PCR. Curiosamente, se
observó una específica de cuatro veces upregulation de Id1 mRNA en BMP-6-B, las células
tratadas (Figura 7]. La sobre regulación de mRNA Id1 era característica de una temprana
de genes inducibles, con upregulation máximo dos horas después de la adición de BMP-6 y
regresó a la línea de base después de 24 horas. En cambio, no se observaron cambios
significativos para Id2 y Id3 ARNm, mientras que Id4-transcripciones no eran detectables
(Figura 7, los datos no presentados).
Western blot reveló que el BMP-6 inducida upregulation de Id1 mRNA también se
correlacionó con upregulation de proteína Id1 también. El aumento en el nivel de proteína
Id1 fue detectable después de una hora y el aumento de hasta 24 horas después de BMP-6
Además, que muestran un 16 veces upregulation comparación con t0 (p ≤ 0,020, n = 4)
(Figura 8 y 9]. De acuerdo con el ARNm de datos, no en consonancia cambio en la
cantidad de Id2 y Id3 proteína se observó (Figura 8 y 9]. Hemos sido capaces de bloquear
la Id1 específicas banda con un bloqueo de péptido (datos no presentados). En conjunto,
estos datos sugieren que Id1 podría ser un posible objetivo de genes para mediar los
efectos de BMP-6 en las células humanas B, mientras que Id2 y Id3 no parecen estar
involucrados.

6. BMP-6 en la producción de células B
El hecho de que BMP-6 se ha informado a actuar como un estimulador autocrino en
condrocitos [18] y ovarium [19], nos llevó a investigar si las células B normales humanos
podría producir BMP-6 a la estimulación. Ramos células, que se han descrito para
expresar BMP-6 mRNA endógena [20], y la línea celular Jurkat T, sirvió como controles
positivos y negativos, respectivamente. Endógena BMP-6 niveles de mRNA en las células
B normales se han cuantificado en tiempo real RT-PCR después de la estimulación con
anti-IgM para diferentes puntos temporales. Curiosamente, la sobre regulación de BMP-
6 mRNA fue característica de la pronta a intermedio de genes inducibles con máxima
upregulation cuatro horas después de la adición de anti-IgM. El nivel de BMP-6 mRNA fue
de nuevo a la base de referencia después de 24 horas tras la estimulación (Figura 10].
Además, ambos FCS y humanos AB-suero se asociaron con una upregulation de BMP-
6 mRNA (Figura 11]. Curiosamente, en otro estudio hemos encontrado que las células T
humano normal no expresan BMP-6 mRNA después de la activación (Sivertsen et al,
manuscrito en preparación). A continuación, hemos querido detectar las proteínas BMP-6
en las células B normales y probado diversos anticuerpos disponibles comercialmente. Sin
embargo, en nuestras manos estos anti-BMP-6 anticuerpos no sólo reconocer la
recombinante de proteínas BMP-6 y no la proteína nativa.
Discusión
Estudios recientes han demostrado un importante papel de los miembros de BMP
superfamilia de las células madre hematopoyéticas, a principios timocitos [6, 7], y células B
malignas [8, 11, 12], pero una función para BMPs humanos normales en células B no ha
sido previamente . El presente estudio demostró un significativo efecto antiproliferativo de
la BMP-6 en la sangre periférica de células B CD19 +. Además, el BMP-6 inducida por la
muerte de las células CD27 + en las células B de memoria, así como en una línea celular
de linfoma de Burkitt (Ramos). Es importante destacar que, BMP-6 indujo una rápida y
notable aumento de la fosforilación Smad-1/5/8. Además, el BMP-6 inducida Smad
fosforilación fue seguido por una selectiva upregulation de Id1 mRNA y la posterior Id1
proteína.
En el presente estudio, el demostrado efecto antiproliferativo de la BMP-6 en el tratamiento
de IgM anti-células B fue significativa y dependiente de la dosis. Es importante destacar
que el efecto anti-proliferativo de BMP-6 podría ser completamente neutralizadas por el uso
de un inhibidor natural, Noggin. Esto está en consonancia con otros, que muestran que
Noggin puede funcionar como un antagonista de BMP-6 [21, 22]. Además, la combinación
de soluble BMP-RIB-BMP-Fc y Fc RII-proteínas de fusión también neutralizar el efecto anti-
proliferativo de BMP-6 en las células B humanos. Curiosamente, como para otros
miembros de la familia TGF, bifuncional efectos también se han demostrado para los
BMPs. Considerando que varios de los BMPs se ha demostrado que promover la
proliferación en diversos tipos de células incluyendo condrocytes [23], [24] el hígado y las
células de la granulosa [25], antiproliferativa y efectos de inducción de la apoptosis ha sido
reportado en B y las células T linaje. Efectos similares como se demuestra por BMP-6 en
las células B humanos en el presente estudio, se demostró por BMP-2, 4, 6 y -7 en células
de mieloma humano [9 - 11]. Otros miembros de la familia BMP-También se ha informado

7. de inducir la apoptosis, incluyendo ratón en el linaje de células B [26]. Además, BMP-4
inhibe la proliferación thymocyte [6]. En conjunto, estos datos sugieren que el papel de los
BMPs en la regulación de la proliferación y la apoptosis de células tipo es altamente
dependiente.
Para examinar la forma en BMP-6 ejerce sus efectos funcionales en las células B,
analizamos la expresión del receptor de BMP occidental blot. Humanos de las células B
periféricas se encontraron para expresar el BMP Ley de los receptores tipo I-RIA y BMP-
RIB, y la tipo II y los receptores BMP-IRD y de la Ley RIIb-, que después de la señal de
varios BMPs vinculantes, incluyendo BMP-6 [16, 13]. Para seguir estudiando BMP-6
inducida de señalización, de la activación de varios trayectos es posible. La principal vía de
señalización se conoce hasta el momento, es la activación de los R-Smads [13, 27]. En ese
sentido, BMPs han demostrado ejercer efectos antiproliferativos en células B linaje a través
de la fosforilación de Smad-R [11, 28]. Además, el BMP-2 se ha demostrado que induce la
activación de STAT3 en células de mieloma [9]. Sin embargo, la fosforilación de R-Smad
no se investigó en ese estudio. BMP-2 también ha demostrado inducir la fosforilación de
p38 [29]. Por lo tanto, la fosforilación de p38, STAT3 y Smad1/5/8 BMP-representan
importantes vías de señalización mediada que los efectos de los BMPs e incluso hablar
cruzadas entre estas vías se ha comunicado [29, 30]. En el presente estudio, no hemos
podido detectar BMP-6-inducida por los cambios en el estado de fosforilación de la STAT3
o p38 en células B periféricas humanos. En lugar de ello, una rápida y marcada de
fosforilación de Smad1/5/8 fue revelado. En un estudio paralelo, hemos encontrado que
otras BMPs también indujo la fosforilación de Smad1/5/8 periférica en células B (datos no
presentados). Estamos actualmente estudios de microarrays para identificar las vías de
señalización y de genes objetivo diferente que se rige por las diferentes BMPs humanos en
células B.
Upregulation de Id1 través Smad1/5/8 fosforilación es un mecanismo conocido para BMP-6
señalización en otros sistemas celulares [31, 32] y la regulación de las proteínas Id-se
piensa que es un mecanismo importante para Smad de señalización [17]. En el presente
estudio, en tiempo real RT-PCR experimentos reveló un cuádruple upregulation para Id1en
BMP-6-B, las células tratadas, en tanto que la suma de Id2-Id4 sigue siendo la misma. De
acuerdo con este, el oeste blot demostró una upregulation de proteína Id1, mientras que la
cantidad de Id2 y Id3 los niveles de proteína se mantuvo sin cambios. Anteriormente, Id1 se
ha considerado que no se expresa en las etapas posteriores de desarrollo de las células
pro-B [33, 34], y su expresión constitutiva ha informado de que afecte el desarrollo de las
células B del ratón [35]. Por lo tanto, nuestra demostración de la función del tiempo
upregulation de Id1 ARNm y proteínas en la madurez normal de las células B humanos es
de particular interés. En este sentido, cabe destacar que la señalización TGF-β y madura a
principios de células B induce tanto Id2 y Id3 expresión [36, 37], pero no Id1 (datos no
presentados). Curiosamente, estos resultados ponen de manifiesto que varios miembros de
la familia TGF-β regulan ID de proteínas diferente. Id2 y Id3 se consideran principalmente
el ID de proteínas expresadas en las células B maduras [38]. El presente estudio también
encontró Id2 y Id3 proteína en las células B, que se expresó más que Id1 células B en
reposo. Sin embargo, BMP-6 no indujo cambios significativos en la expresión de la proteína
de Id2 y Id3. Se cree que las proteínas Id bloque de promover la proliferación y
diferenciación en diversos tipos de células [39, 33]. Id proteínas actuar como dominante
negativo de los inhibidores de E-Pax5 función de las proteínas y por la formación de

8. dímeros con estas proteínas, lo que los hace incapaces de obligar a ADN. Se ha propuesto
que el equilibrio entre E-proteínas, y Pax5 Id proteínas podrían tener un papel importante
en activar células B [38]. En ese sentido, E-proteínas han estado implicados en la
promoción y la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de células en diferentes
puntos de linfocitos en desarrollo [40]. La muerte y antiproliferativa efecto inductor de BMP-
6 en las células B, con la consiguiente upregulation de Id1 proteína es, por lo tanto, en
línea con la opinión de que la ID de proteínas son necesarios para la inducción de la
detención del crecimiento y la apoptosis de los linfocitos B-progenitores por TGF-β [40 ].
Además, la ID de proteínas se conocen como partes importantes de vías de señalización
implicadas en el desarrollo, ciclo celular y tumorigénesis [32]. Es bien sabido que varios
miembros de la familia Id se sobreexpresa en una variedad de tumores humanos y, en
general, Id1 parece ser el miembro de la familia que más se sobreexpresa en una variedad
de tumores malignos humanos [41], incluyendo el mieloma múltiple [42, 32] . Además,
nuestras conclusiones de que BMP-6 activa vías de señalización intracelular en las células
B humanos podría ser de potencial importancia fisiopatológica en el linfoma y la
inflamación. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG Se ha demostrado que se
correlaciona con resultados desfavorables [12]. En este sentido, es de interés que la
expresión de Id1 dirigidos a los linfocitos B-aberrante resultado en el desarrollo de las
células B, la apoptosis masiva, y el posterior desarrollo de linfomas de células B [35]. Por
otra parte, BMP-6 ha sugerido que desempeñar un papel en la artritis reumatoide (AR)
[43, 44] y niveles elevados de Id1 y Id3 se han encontrado en la synovia de la AR-pacientes
[45]. En conjunto, estos resultados apuntan a un papel importante para el ID de proteínas
en la regulación de la homeostasis de células B normales y en las enfermedades, en donde
las células B están implicadas. Por lo tanto, será aún más importante para dilucidar el papel
de Id-1 en humanos de células B selectivo por más de la inhibición de la expresión o Id-1 la
expresión génica.
Teniendo en cuenta el rol de BMP-6 en las células B maduras humanos demostrado aquí,
la identificación de BMP-6 la producción de las células in vivo con la posibilidad de
interacción con la ingenua y la memoria células B podría contribuir a la comprensión de la
biología de células B maduras. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG se ha detectado
por la expresión de genes de perfiles [12]. Además, la producción de BMP-
6 transcripciones de las células B normales activado se detectó en el mismo estudio. De
nota, un autocrina BMP-6 bucle ha sido informado por otros en los condrocitos y en el
ovarium [46, 19, 18]. Por lo tanto, hemos querido explorar la posibilidad de que un
autocrina BMP-6 bucle de las células B en humanos. Analizamos la expresión de BMP-
6 mRNA en la sangre periférica de células B por PCR en tiempo real, y aquí el informe de
upregulation endógeno BMP-6 transcripciones después de la estimulación con FCS, suero
humano AB-y, lo que es más importante, anti-IgM. Sin embargo, nuestros intentos de
estudio BMP-6 niveles de proteína no tuvieron éxito debido a los problemas con
inespecíficos vinculante de la anti-BMP-6 a prueba de anticuerpos, y la falta de tinción
específica en el control de las células conocidas para expresar BMP-6 mRNA. Por el
contrario, la proteína recombinante fue fácilmente detectado. En ese sentido, algunos
investigadores han detectado proteínas BMP-6 en los seres humanos, sobre todo en el
tejido no patógena. La posibilidad de BMP-6 humanos en la producción de las células B
está en línea con un trabajo reciente que informó de la producción de BMP-6 en las células
B del ratón, la infiltración de la médula ósea de ratones con artritis inflamatoria [43]. En este

9. estudio, un papel para inflammatoric BMPs en el proceso de la artritis se sugirió. El
upregulation del BMP-6-después de las transcripciones IgM-crosslinking es fisiopatológicos
de interés [12]. Una pérdida de TGF-β-respuesta ha sugerido a ser una contribución
fundamental para la transformación maligna [47, 48] y similares mecanismos oncogénicos
se han postulado para BMPs. Líneas de pruebas [49] sugieren que en las primeras etapas
de la carcinogénesis, BMP-6 no es un promotor del tumor, pero suprime los tumores
benignos y malignos resultado. Estos resultados están en buen acuerdo con resultados
anteriores de otros TGF-β miembros de la familia, incluido el TGF-β1, y BMP-4 [50], lo que
indica que celulares BMP contexto de la meta de células podría definir los diferentes
efectos observados. En contraste con el upregulation BMP-6 de transcripción en las células
B, no hemos podido detectar BMP-6 transcripciones en sangre periférica humana CD4 + o
células T CD8 + (reposo o estimulación con anti-CD3 y anti-CD28; datos no Muestra), en
consonancia con las conclusiones de líneas de células T [20] y de las células T en ratones
[43]. Otras posibles fuentes de BMP-6 para madurar las células B in vivo pueden ser otras
células del sistema inmunitario o de tejidos con el contacto con el sistema hematopoyético.
Una fuente bien reconocida por BMP-6 es la producción de huesos humanos y de la
médula ósea estroma [51, 8]. Por otra parte, cabe destacar que la vena umbilical humana
células endoteliales (HUVEC) altamente expresar BMP-6 mRNA [52], y el endotelio
vascular ha informado a producir BMP-6 [53]. Estos estudios podrían implicar un papel para
BMP-6 en transendothelial migración de las células B. BMP-6 mRNA se ha demostrado en
líneas celulares de macrófagos murinos, pero no en los seres humanos [54]. De acuerdo
con estos resultados, otras líneas celulares humanas de los neutrófilos y monocitos origen
se han descrito como negativa para el BMP-6 transcripción [20]. Que sepamos, no hay
actualmente ningún informe acerca de BMP-6 producción de las células dendríticas
humanas.
Conclusión
En conclusión, nuestros resultados muestran que BMP-6 induce la activación de la
señalización intracelular Smad maduras en humanos de células B consecutivos con la
producción de la proteína Id1. Además, nos informan de que BMP-6 tiene un efecto
antiproliferativo en células B estimuladas con anti-IgM solo o la acción combinada de IgM y
anti-CD40L. Además, el BMP-6 induce la muerte celular en las células B de memoria
activada y Ramos células. En conjunto, estos resultados proporcionan un fundamento de
examinar más a fondo la función de señalización de BMP-6 en células B normales de la
biología, así como en condiciones patológicas como células B malignas y trastornos
autoinmunes.
Métodos
Cultivo de células
Si no se especifica, todas las células se cultivaron en VIVO X-15 ™ (BioWhittaker, Verviers,
Bélgica) en suero libre de medio a 37 ° Cy 5% de CO 2 en el aire.
Sangre periférica fue proporcionada por el Banco de Sangre en el Hospital Regional de
Buskerud con el acuerdo formal por los pacientes, y la aprobación por el comité

10. de éticaregional. Altamente purificada descanso humanos de los linfocitos B (células
CD19 +) fueron aisladas de la sangre periférica por rosetting inmunomagnética con piedras
(Dynabeads M450; Dynal, Oslo, Noruega), tal como se describe [55]. Este procedimiento
produce menos del 0,5% de las células T, las células NK 0,1%, 0,5% y monocitos como
juzgados por la tinción de inmunofluorescencia indirecta.
Las siguientes líneas de células humanas de neoplasias linfoides se mantuvieron en RPMI
1640 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) suplementado con 10% de suero fetal
bovino (FCS), 100 unidades / ml penicilina G, y 100 unidades / ml de sulfato de
estreptomicina, pero - Suero de hambre durante al menos cuatro horas y cultivadas en
VIVO X-15 ™ cuando se incluyen en los experimentos: EBV negativos-BL líneas celulares
Ramos (ECACC 85030802), HL60 (JCRB0085).
Factores de crecimiento / suplementos
Los siguientes son los reactivos utilizados en las concentraciones indicadas: recombinante
humana (rhu) BMP-6 (1 μ g / ml, si no se especifica otra cosa), rhu BMP-RIB/ALK-6/Fc
Quimera (5 μ g / ml), rhu BMPR - II / Fc Quimera (5 μ g / ml), y el ratón Noggin
recombinante (5 μ g / ml) fueron adquiridos de los sistemas de I + D (Abingdon, Reino
Unido); Anti-IgM F (ab) 2 fragmentos de anticuerpos policlonales de conejo a la cadena
pesada de IgM (37,5 μ g / ml) se obtuvo de Dako, Copenhagen, Dinamarca y rhu CD40
ligando (CD40L, 10 ng / ml) fue un regalo de Immunex Corp (Seattle, WA).
Los anticuerpos utilizados para el análisis de citometría de flujo y
análisis de inmunoblot
Anticuerpos humanos contra la Ley de los receptores BMP-RIA-, BMP-RIB, BMPR-II, la Ley
y la Ley-RIIA-RIIb se compraron de R & D Systems (Abingdon, Reino Unido). Detección de
la BMP-6-proteína se ha probado con los siguientes anticuerpos: cabra policlonal anti-BMP-
6 (Santa Cruz, San Diego, CA, EE.UU.), mouse monoclonal anti-BMP-6 y cabra policlonal
anti-BMP-6 De R & D Systems (Abingdon, Reino Unido), y mouse monoclonal anti-BMP-6
(Chemicon International Inc, Temecula, CA, EE.UU.).
BMP-Caracterización de vías de señalización se hace mediante el uso de anti-fosfato
Smad1, -5, y 8-anticuerpo policlonal (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). Los niveles de
expresión de Id1-3 proteínas se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo y la
detección fue bloqueado con el bloqueo péptido Biotecnología de Santa Cruz (Santa Cruz,
San Diego, CA, EE.UU.). Como secundaria de anticuerpos anti-ratón sirve, la lucha contra
la cabra o IgG anti-conejo-peroxidasa de rábano (HRP) de Dakocytomation AS
(Copenhague, Dinamarca) para el análisis de inmunoblot. Anti-β-actina fue de Santa-Cruz.
De Becton Dickinson (San Jose, CA), que compró anti-CD19-PE, anti-CD19-FITC. Los
anticuerpos utilizados para la selección de células CD19 eran anti-PC5 de Immunotech SA
(Marsella, Francia) y anti-CD27 PE de Becton Dickinson, Pharmingen Biosciences (San
Diego, CA, EE.UU.).
Cell sorting

11. Altamente purificada CD19 + CD27 - o CD19 + CD27 + células se obtuvieron mediante la
tinción de células CD19 + con anti-CD27 y CD19 PE PC5 mAbs durante 30 minutos a 4 ° C,
seguido de un lavado con PBS y la clasificación sobre FACS DiVa de Becton Dickinson.
Western-blot
B células de sangre periférica o de las líneas de células cultivadas fueron lisadas en buffer
de lisis (10% de glicerol, β-mercaptoetanol 5%, 0,0625 M Tris-HCL [pH 6,8], dodecil sulfato
de sodio [SDS] 2,5% w / vol). Proteínas totales (30-100 μ g) de cada muestra, se ha
ejecutado el 10% o 12% SDS / poliacrilamida (SDS / PAGE) geles y borró en filtros de
nitrocelulosa (Protran; Schleicher y Schuell GmbH, Dassel, Alemania). Bloqueo, la
incubación y el lavado de los filtros con anticuerpos primarios se realizaron de acuerdo con
los protocolos del fabricante a temperatura ambiente (RT). Después de un lavado con
TBS/0.1% de Tween-20 (TBS-T), los filtros se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP)
junto a la secundaria de anticuerpos (véase más arriba) durante 60 minutos a TA. La
actividad enzimática fue visualizado por el mayor sistema de quimioluminiscencia,
ECL +PLUS (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Densitométrica análisis se realizó
mediante el escaneo de una hyperfilms Personal Densitometer SI (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA). Cuantificación de Id1, Id2 y Id3 proteína se calculó por la normalización de
la proteína específica a bandas de β-actina usando el software Image Quant 5,5 (Molecular
Dynamics).
Análisis de las BMP-6 ARN mensajero (ARNm) de expresión
Endógena expresión de los genes BMP-6 fue examinado por transcripción inversa-reacción
en cadena de polimerasa. Total RNA se aisló ARN usando Absolutamente ™ RT-PCR
Miniprep Kit (Stratagene Europa, Amsterdam, Países Bajos), con arreglo a las
instrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN total aislado se logró mediante el
uso de espectrofotométrico OD 260 mediciones. Igual cantidad de ARN se transcribe a
continuación, invertir cDNA con TaqMan ® Reactivos Transcripción Reversa (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para medir la expresión de mRNA BMP6, Id1-Id4 y
PGK1 PCR se llevaron a cabo con TaqMan ® universal maestro de la mezcla. Primers y
sondas fueron proporcionados por ensayo-on-Demand (Applied Biosystems). Las
reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 μ l (BMP-6) o 20 μ l (ID1). El
cDNA añade a cada reacción fue equivalente a la aportación de 20 ng de RNA total. La
expresión genética se cuantificó utilizando el método estándar de la curva (BMP6), o el
método comparativo C T (Id1) como se describe en el Boletín ABI7700 usuario 2 (Applied
Biosystems). La expresión fue normalizado a nivel de la expresión PGK1. PGK1 se eligió,
porque se ha demostrado que tiene un nivel bajo de expresión variabilidad de los
especímenes de linfocitos [56]. Los niveles de expresión en las células B son entonces
relacionadas con los niveles de expresión en las células Ramos.
La proliferación de las células
Para la estimación de la síntesis de ADN, las células CD19 + (7,5 × 10 4 cells/0.2 ml) o
Ramos células (1 × 10 4 cells/0.2 ml) se cultivaron en microtiter triplicado en los pozos. Las
células fueron pulsados con el 3,7 × 10 4 Bq [3 H] timidina (Amersham, Buckinghamshire,

12. Reino Unido) de los últimos 16 h de un 72-h de incubación. Las células fueron recolectadas
utilizando una cosechadora automática de células (Instrumento Packard Company,
Meriden, CT, EE.UU.), y [3 H] timidina incorporación se determinó en un contador
scintillation (TopCount, Packard Instrument Company Inc, Meriden, CT).
Determinación de la muerte celular
Muerte celular se midió por el colorante vital exclusión de prueba por la tinción de las
células con 5 μ g / ml de yoduro de propidio ([PI]; Calbiochem Corp; La Jolla, CA; 5 mg /
ml) durante un minuto en hielo. Por lo menos 1000 células por muestra se ejecutan en un
flujo FACSCalibur BD cytometer.
Análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó a través de los
pares de dos colas con técnicas de prueba de Wilcoxon, mediante la aplicación de
SPSS10.1 software (SPSS Inc, Chicago, IL, EE.UU.). Los valores de p inferior a 0,05 se
consideró significativo.
Lista de abreviaturas
BMP, la proteína morfogénica ósea
LBDCG, difuso de células B grandes linfoma
Id, inhibidor de la ADN obligatorio
Smad, el nombre Smad se origina a partir de la proteína de Drosophila, MAD y
el Caenorhabditis elegans proteínas, pequeñas-2, 3 y 4
STAT, transductor de señales y activador de la transcripción
Contribuciones de los autores
CK diseñado y llevado a cabo experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel.
EAS diseñó y llevó a cabo experimentos, supervisó la investigación. MEH diseñado y
llevado a cabo experimentos, supervisó la investigación. LF diseñado y llevado a cabo
experimentos. EBS diseñado experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel.
JHM designed and conducted experiments, oversaw research, and wrote paper.

13. COMENTARIO
El artículo sobre el BMP-6, que inhibe la proliferación de linfocitos B, activa
una serie de reacciones que terminan en la inhibición de la proliferación de
esta célula, también a través de la inhibición de las inmunoglobulinas M,
además de CD 40L, no solo eso, sino que estimula a la eliminación de las
células B de memoria. El BMP no solo es inducido por células neoplasicas
sino también puede ser administrado para el uso aplicativo de contra
algunas enfermedades ya que como hemos visto interactúa con la célula
de maneras diferentes.

14. RODRIGUEZ ANTUNEZ JUAN
1109000569