El documento trata sobre la validación de métodos analíticos cuantitativos, cualitativos y semicuantitativos. Explica que la validación incluye parámetros como la linealidad, exactitud, precisión, veracidad, incertidumbre, selectividad, sensibilidad, límites de detección y cuantificación, y robustez. Detalla los procedimientos estadísticos para analizar estos parámetros y proporcionar evidencia objetiva de que el método es válido y los resultados son confiables.

1. Validación Métodos AnalíticosValidación Métodos Analíticos
Cuantitativos, Cualitativos yCuantitativos, Cualitativos y
Semicuantitativos.Semicuantitativos.
Rigoberto Marcelo Yáñez VeraRigoberto Marcelo Yáñez Vera
Diciembre 2011Diciembre 2011

2. Norma NCh2547.Of 2003Norma NCh2547.Of 2003
5.5 Procedimientos Analíticos.
5.5.2 El laboratorio debe usar sólo
procedimientos validados.
VALIDARVALIDAR VERIFICARVERIFICAR

3. ValidaciónValidación
“Confirmación mediante el examen
y la obtención de evidencias
objetivas que aseguran el
cumplimiento de una serie de
requerimientos particularmente
definidos para aplicaciones
concretas”
(ISO 8402-1994 o NCh2000 – ISO 8402).

4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS
CUANTITATIVOS
Parámetros de calidad (desempeño analítico):
- LINEALIDAD
- EXACTITUD:
-PRECISIÓN: *Repetibilidad
*Reproducibilidad
-VERACIDAD, Trazabilidad
- INCERTIDUMBRE
-SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS
- SENSIBILIDAD
- LÍMITE DE DETECCIÓN
- LÍMITE CUANTIFICACIÓN
- ROBUSTEZ

5. Concentración
Respuestadelinstrumento
Intervalo
lineal
LL
LC
LD
LL = L. de linealidad
LC = L. de Cuantificación
LD = L. de Detección
ANÁLISIS CUANTITATIVO

6. -LINEALIDAD
Capacidad del método analítico de obtener
resultados linealmente proporcionales entre la
concentración del analito y su respuesta.
Análisis estadístico:
*Curva regresión y = a + b x
*Coeficiente de determinación r2
*Análisis de varianza (regresión) con
Estimación falta de ajuste
Error residual puro.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Si p>0,05 es
significativo y por
ende los datos
tienden a ser lineales.

7. 1 Selección del modelo: Normalmente una línea recta
y = a + b x
2 Establecimiento del diseño experimental:
 dominio experimental: rango de concentraciones
 distribución de las medidas
 número de medidas.
3 Estimación de los parámetros del modelo. Regresión
por mínimos cuadrados.
4 Validación del modelo: ANOVA.
ETAPAS DE LA REGRESIÓN

8. Linealidad: Curva de Calibración IgG
INMUNONEFELOMETRÍA
X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544
Concentración (mg/dL) Medición 1 Medición 2
Medición instrumental (señal): intensidad de la luz dispersada
por los complejos antígenos-anticuerpos.

9. CONCENTRACION mg/dL
LECTURA
0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
CURVA CALIBRACION IgG

10. log conc.
loglectura
INMUNONEFELOMETRÍA
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
CURVA CALIBRACIÓN IgG

11. Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado
de una medición y el valor de referencia
aceptado o verdadero
Nota: El término “exactitud” cuando se aplica a
un conjunto de resultados de mediciones implica la
combinación de los componentes aleatorios y de un
error sistemático común o de un componente de sesgo
(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

12. Exactitud
(Norma ISO 3534-1)
-Precisión: grado de concordancia entre
resultados de mediciones obtenidas
independientes bajo condiciones establecidas.
-Veracidad: grado de concordancia entre el valor
medio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.
Exactitud = Precisión + Veracidad

13. Precisión
La precisión depende sólo de la distribución de errores
aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor
verdadero o el valor especificado.
-Repetibilidad
-Precisión intermedia o reproducibilidad
intralaboratorio
-Reproducibilidad
(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

14. REPETIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de un método
efectuado en las mismas condiciones, sobre el
mismo analito, con el mismo método,con el
mismo operador, utilizando el mismo instrumento
de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
PRECISIÓN:
Grado de concordancia entre resultados de mediciones
obtenidas de una serie repetida de análisis, sobre una
muestra homogénea, bajo condiciones establecidas
(Norma ISO 3534).
ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

15. Media
Desviación estándar
Coeficiente de variación
Análisis de varianza F (comparación de la
desviación estándar)
Estudio homogeneidad muestra:
Análisis de varianza (F)
Prueba de “t”de Student.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA PRECISIÓN

16. REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA LA
DETERMINACIÓN IgG.
Homogeneidad muestra
Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %
“t” calculado = 0.0713 < “t” tabla 5;0.025 = 2.571

17. REPRODUCIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de los resultados de
un método analítico efectuado sobre el mismo
analito, pero en condiciones diferentes (diferentes
equipos utilizados, el operador, el período de
tiempo, etc.)
ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
PRECISIÓN

18. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG
IgG mg/dL
DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3
1556 1568 1564
1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568

19. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG
n 18 (en tres dìas diferentes)
media 1557.72
DE 12.27
CV 0.8 %
Precisión 99.2 %
Análisis de Varianza
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC gl CM F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 17

20. VERACIDAD:
Grado de concordancia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y el valor de
referencia aceptado (certificado). Norma ISO 3534
Análisis estadístico
Media experimental
Desviación estándar experimental
Prueba de “t” de Student
ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

21. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG
MRC DB Lote 084705 931,8
IgG mg/dL 942,3
n = 10 951.8
924,8
918,6
927.1
920,5
938,4
935,2
918,8
Media experimental 930.9
Media certificada 925.0

22. Valor exp. MRC
media 930,9 925
s (DE) 11,0545
“t” calculado = 1,6963 <“t” (tabla) 9;0.025 = 2,262
p = 0,124
( )
s
nμΧ
t
α/21,-n
×−
=
VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG
Se acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad

23. Incertidumbre
Magnitud asociada con el resultado de
medición que caracteriza la dispersión de los
valores que razonablemente podrían ser
asignados al mesurando

24. Incertidumbre
-Incertidumbre estándar:
Incertidumbre de un resultado de medición
expresada como desviación estándar.
-Incertidumbre estándar combinada:
Incertidumbre estándar como resultado de una
estimación mediante la propagación de errores con
base en las incertidumbres individuales.
-Incertidumbre expandida
Incertidumbre estándar que se expresa como un
intervalo de confianza.

25. gl = n - 1 (grado libertad)
nivel α = 0,05
CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA
U MRC IgG exp. = ± 7,9 mg/dL
( )
n
s
tU 1-nα/2;
x ×±=

26. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
Capacidad del método analítico para medir en
forma exacta un analito particular dentro de
una mezcla compleja, sin interferencia de
otras sustancias o analitos.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN
Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando pero afecta al
resultado de la medición (interferencia).

27. Interferencia de la
señal
Algunos compuestos presentes en la muestra
por un artefacto aumentan o disminuyen la
magnitud del mecanismo de detección.
Ejemplos:
Fluoresceína, EDTA , Azida de Sodio, Lípidos,
Complemento, Fibrinógeno, Albúmina

28. Detección y control de interferencias
 Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado
verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de
literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de
ausencia de interferencia para valores definidos de las
magnitudes.
 Verificar resultados de pacientes con condiciones clínicas
asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas,
fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro
clínico.
 Inspeccionar las muestras visualmente buscando
hemólisis, ictericia, lipemia o evaluarlas usando
índicadores séricos.

29. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS
1 Prueba de dilución lineal (las interferencias no se
comportan linealmente con la dilución).
2 Analizar la muestra por otro método (comparación de
métodos).
3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir
sustancias potencialmente interferentes.
4 Análisis de muestras enriquecidas con el interferente.

30. SENSIBILIDAD
Es la capacidad de un método analítico de
registrar ligeras variaciones de la concentración.
ms
b
γ =
ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
γ = Sensibilidad
b = Pendiente obtenida desde la regresión lineal.
Sm = desviación estándar de la muestra.

31. LÍMITE DE DETECCIÓN (LD)
Menor concentración o cantidad de analito detectable
con razonable certeza por un procedimiento analítico
dado. Concentración que proporciona una señal en el
instrumento significativamente diferente de una
muestra blanco.
b
s* 3 y
LD bl
bl +
=
ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
Ybl = señal promedio del blanco.
Sbl = desviación estándar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del
analito.

32. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)
Es la menor concentración de analito que puede
determinarse con precisión y exactitud razonables en
las condiciones establecidas y se expresa en unidades
de concentración.
b
s* 10 y
LC bl
bl +
=
ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
Ybl = señal promedio del blanco.
Sbl = desviación estándar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del
analito.

33. ROBUSTEZ:
Grado de concordancia de los resultados al efectuar
cambios en las condiciones operativas y ambientales
normalizadas del método.
ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN

34. Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeñas pero deliberadas
variaciones en los parámetros del método y provee
información de su comportamiento en la rutina.
 Parámetros estudiar:
-Efectos del congelado-descongelado
-Tiempos de incubación
- Cambio pH tampones
-Temperaturas de incubación
-Longevidad de los reactivos
-Preparación de la muestra
-Conservación de la muestra.
ROBUSTEZ

35. NORMA NCh 2446.Of1999– Guía para la
validación de métodos de ensayo – Principios y conceptos
generales
5 Procedimiento de validación
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de
acreditación deben contar con procedimientos y directrices
para planificar y controlar el proceso de validación de
métodos de ensayo. Sin embargo, la discusión anterior ha
indicado claramente que no puede desarrollarse un
procedimiento único. En consecuencia, tiene que
desarrollarse una gama de diferentes alternativas de técnicas
de validación. Cuán detallada deba ser la validación, depende
de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).

36. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patologia Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, al
menos las siguientes características metrológicas:
1.-Error sistemático (sesgo). El fabricante del calibrador deberá
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados.
Sin embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que el
proceso proporciona resultados satisfactorios
2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberá
proporcionar la información de las interferencias.

37. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patologia Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Límite de detección. El fabricante deberá propocionar
especificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección.
El Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuando
observa diferencia.
5.-Contaminación
6.-Verificar dilución

38. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de
Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
Recomendación de validación de métodos de acuerdo
a la complejidad de la prueba o determinación:
-Pruebas de mínima complejidad (waived tests). No
hay recomendación para la validación de método.
Seguir directrices del fabricante.

39. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de
Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados
por el FDA los estudios de validación de métodos deberian seguir las
siguientes recomendaciones:
-Verificar los parámetros de calidad o especificaciones de
desempeño (demostrar resultados comparables a los establecidos por el
fabricante): -Exactitud
-Precisión
-Rango de los resultados analíticos reportado por el
método
-Verificar que los intervalos de referencia del fabricante
son apropiados para la población de pacientes del
laboratorio.

40. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de
Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados
por el FDA
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparación de métodos para estimar la inexactitud o
sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
-Hacer estudio de linealidad para estimar el
rango de la determinación reportado por el fabricante
-Obtener valores de referencia para verificar intervalo de
referencia indicado por el fabricante

41. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de
Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio, la validación de los métodos requiere:
-Exactitud
-Precisión
-Sensibilidad analítica
-Especificidad analítica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
-Rango de los resultados analíticos reportado por el método
-Intervalo de referencia (valores normales)
-Cualquier otro parámetro requerido para el desempeño del método

42. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de
Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
-Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
-Límite de detección para estimar interferencias permanentes
-Experimentos de recuperación para estimar proporción de
interferencias
-Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia

43. Métodos Cualitativos y/oMétodos Cualitativos y/o
SemicuantitativosSemicuantitativos
 En los laboratorios de análisis se generan
cada vez más mediciones que dan respuesta
rápidas de tipo cualitativo.
 Respuesta de tipo binario: Si / No .
 Presencia o ausencia de determinado analito.
 Presencia o ausencia de un determinado nivel del
analito.
 Se denominan sistemas de “screening”.

44. Sistemas de Screening
 Muchas veces se utilizan como una etapa previa
para luego realizar un análisis cuantitativo.
 Evita análisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
 A nivel microbiológico generalmente en
identificación bacteriana son diagnósticos y no
presuntivos.

45. Análisis cualitativoAnálisis cualitativo
Sistema de
tamizaje
(screening)
Sistema de
tamizaje
(screening)
Análisis
cuantitativo
Análisis
cuantitativo
No se
analiza
No se
analiza
> 2 ng/mL
< 2 ng/mL
NO
SI
•Menor experimentación.Menor experimentación.
•Decisión rápida.Decisión rápida.
•De fácil manejo, portátiles, etc.De fácil manejo, portátiles, etc.
•Sin necesidad de equipos.Sin necesidad de equipos.
•Ahorro.Ahorro.
Presencia del analito
Ausencia del analito
Método Confirmatorio

46. Sistemas de Medida CualitativosSistemas de Medida Cualitativos
Análisis cualitativo clásico o sensorial:
Color: cambio, aparición.
Olor.
Turbidez.
ELISA.
Crecimiento bacteriano.
Detección instrumental:
UV: fluorescencia, potenciometría.
Sensores: químicos, bioquímicos, etc.
ELISA.

47. Análisis cualitativo clásico oAnálisis cualitativo clásico o
sensorialsensorial
 La respuesta binaria SI / NO se obtiene
directamente.
 En general la presencia del analito se
determina por comparación con un blanco.
 Pruebas baterías bioquímicas
 Se encuentran también las pruebas de Kits.
 Son dispositivos comerciales para pruebas
concretas.
 Contienen todos los reactivos necesarios.
 Pueden contener algún instrumento sencillo.

48.  Pruebas de kits:
 Látex para serotipificar Streptococcus.
 Tiras de orina.
 Pruebas rápidas para meningitis bacterianas.
 API.
 Método de CIM por microdilución en microplacas
 Coaglutinación.
 Método ELISA rápido para detección C. difficile
Análisis cualitativo clásico oAnálisis cualitativo clásico o
sensorialsensorial

49.  La determinación se hace mediante una
medida instrumental:
 Colorimetría.
 Fluoresencia.
 La presencia o no de un determinado analito
puede ser el nivel límite de detección o a un
nivel superior.
Análisis Cualitativo SensorialAnálisis Cualitativo Sensorial

50.  La respuesta instrumental que se obtiene se
transforma en respuesta binaria SI/NO e
implica un tratamiento de datos.
 Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
 Valor de absorbancia para la concentración
correspondiente .
 Si el valor es superior la respuesta es Si.
 Ej. Métodos automatizados para Hemocultivos.
 Ej. Métodos automatizados para CIM.
 Ej. Estandarización automatizada a 0,5 MF.
Análisis Cualitativo SensorialAnálisis Cualitativo Sensorial

51. Método de ELISAMétodo de ELISA
 Método Semicuantitativo.Semicuantitativo.
 Se basan en una reacción inmunológica .
 La detección puede ser sensorial o
instrumental.
 Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .
 Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampión, etc.
 Ej. Parásitos: Chagas
 Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.

52.  Métodos cualitativos también deben validarse.
 Validar consiste en verificar y documentar su
validez a requisitos específicos.
 La validación implica como etapa previa la
definición de los requisitos analíticos o de
calidad.
 Luego entonces la determinación de estos
requisitos.
 Los resultados se expresan diferente a los
métodos cuantitativos.
Validación Métodos CualitativosValidación Métodos Cualitativos

53. Métodos Cualitativos
Análisis Cualitativo / screening
SI / NO
Con probabilidad
de error
También tiene dos valores el primero binario y el
segundo es la probabilidad de error asociada a
la decisión tomada.
Se expresan en términos probabilísticos.
Expresión de ResultadosExpresión de Resultados

54. Requisitos de CalidadRequisitos de Calidad
Método Cuantitativo Método Cualitativo
• Linealidad.
- Homogeneidad.
• Precisión:
- Repetibilidad.
- Reproducibilidad.
- Robustez.
• Veracidad (exactitud).
• Incertidumbre.
• Limite de detección.
• Límite de cuantificación.
• Rango de cuantificación
• Selectividad e Interferentes.
• Especificidad.
• Sensibilidad.
• Valor predictivo positivo (VPP).
• Valor predictivo negativo (VPN).
• Exactitud diagnóstica.
• Límite de corte (cut-off).
• Incertidumbre o región de error.
• Límite de detección.
• Robustez.

55. EspecificidadEspecificidad
 Se define como la capacidad o habilidad del
sistema de detectar en forma exacta un
analito en una matriz.
 Grado en que un método se ve afectado por
otros componentes de la muestra
(interferencias) en su capacidad para
detectar en forma única un analito en
particular en una matriz.
 Se expresa como probabilidad.

56. Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Método
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de muestras sin el analito, cuyo método es
negativo:
E = VN / (VN + FP)E = VN / (VN + FP)
Especificidad (E)Especificidad (E)

57.  Capacidad del método para detectar la
menor cantidad del analito particular en una
matriz sin interferencia de otros analitos.
 Es la capacidad o habilidad del sistema de
detectar muestras positivas cuando
realmente son positivas.
 Se expresa como probabilidad.
 Concentración de un analito necesaria para
producir una unidad de cambio de lectura
instrumental.
SensibilidadSensibilidad

58. Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Método
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de muestras que contiene el analito cuyo
método es positivo:
S = VP / (VP+FN).S = VP / (VP+FN).
Sensibilidad (S)Sensibilidad (S)

59. Falsos Negativos (FN)Falsos Negativos (FN)
 Desviación negativa.
 El método a validar da un resultado negativo
y el método de referencia da positivo.
 Corresponden a muestras que contienen uno
o más analitos por encima del valor límite
permitido y que en prueba de screening dan
respuesta negativa.
 Se concluye con este resultado previo que la
muestra no contiene el analito en los niveles
fijados cuando si lo contiene.

60.  Desviación positiva
 Corresponden a aquellas muestras que
realmente no contienen el analito en el nivel
definido y que por Ej. la prueba de screening
lo detecta.
 Se produce cuando el método a validar
proporciona un resultado positivo sin
confirmación y el método de referencia da un
resultado negativo.
Falsos Positivos (FP)Falsos Positivos (FP)

61. Exactitud DiagnósticaExactitud Diagnóstica
 Proporción de resultados correctos
(verdaderos positivos + verdaderos
negativos).
 Es el grado de concordancia entre el
resultado obtenido en un ensayo y el valor de
referencia que debiera obtenerse.

62. Analito
presente
Analito
ausente
Método
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos(FP)
Método
negativo
Falsos
negativos(FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporción de resultados correctos :
ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
Exactitud Diagnóstica (ED)Exactitud Diagnóstica (ED)

63. Límite de Corte oLímite de Corte o Cut-offCut-off
 Limite de cuantificación??
 Número mínimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que pueden
determinarse bajo las condiciones
experimentales del método evaluado.
 Aplicado a análisis microbiológicos
cuantitativos.

64. Resultados métodos
Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
Límite de Corte (cut-off)

65. Definiciones de Requisitos de CalidadDefiniciones de Requisitos de Calidad
 Valor del Límite de Corte (cut-off). Valor de corte del método, dado
principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y
bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una dicotomía
(presencia/ausencia, si/no, etc.).
C= 2ng/mL

66. Definiciones de Requisitos de CalidadDefiniciones de Requisitos de Calidad
 Región de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisión del método, es
un rango donde encontramos error Tipo I o α (Falsos positivos) y Tipo II
o β (falsos negativos) del método.
C= 2ng/mLα β

67. Definiciones de Requisitos de CalidadDefiniciones de Requisitos de Calidad
 Región de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2):
 C50: Concentración del analito donde se produce un 50% de resultados positivos y un
50% de resultados negativos.
 Intervalo C5 – C95: Rango de concentraciones requeridas del analito donde a
concentraciones < de C5, son resultados concretamente negativos y > C95 son concretos
positivos.
Verdaderamente Negativas. Verdaderamente Positivas.C50

68. Límite de DetecciónLímite de Detección
 Cantidad mínima de analito que puede ser
detectado en una muestra pero que no
puede ser estimado con precisión o sea que
no necesariamente es cuantificado en las
condiciones del ensayo.
 Aplicado a análisis microbiológicos
cualitativos.
 Los resultados se expresan como detectado /
no detectado.

69. RobustezRobustez
 Efecto Matriz:Efecto Matriz:
 Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado
por pequeñas pero deliberadas variaciones en los
parámetros del método y provee información de su
comportamiento en la rutina.
 Identificar variables que pueden tener efectos significativos
en la respuesta del método.
 Analizar cada set en condiciones experimentadas dadas y
determinar el efecto de cada cambio.
 Efectos congelado/descongelado, tiempos y temperaturas
de incubación, cambios pH, preparación y conservación de
la muestra y reactivos.

70. ResumenResumen
Definiciones Requisitos de CalidadDefiniciones Requisitos de Calidad
 Especificidad. Proporción de muestras negativas (no reactivas) que
son correctamente identificadas.
 Sensibilidad. Proporción de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
 Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, dé positiva por el método.
 Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, dé negativa por el método.
 Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra de
ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba resulta
reactivo.
 Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra de
ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.
 Exactitud diagnóstica analítica. Capacidad del método para
detectar correctamente los positivos y los negativos.

71. ObservacionesObservaciones
 Hay pruebas en las que tiene un impacto a
nivel de Salud pública además de individual
dar un resultado Falsos + o Falso -.
 Ej. VIH
 En resistencia antibiótica es de mayor
impacto los falsos negativos, o sea informar
como sensible cuando es resistente.
 De mayor trascendencia también en Falsos -:
 Hemocultivos, meningitis, resistencia antibiótica,
VIH, etc.

72. Método ideal
‘Normal’ Enfermo
Valores
método
No falsos positivos o negativos
Nrdeindividuos

73. Realidad métodos
Normal, sin el analito Enfermo, con el analito
Valores
Método
+2SD
Falsos
Negativos
Falsos
Positivos
Nrdeindividuos

74. Resultados métodos
Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos Positivos
Definiciones del ejemplo

75. Resultados método
Pacientes “negativos” Patientes “positivos”
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
Positivos
Definiciones del ejemplo

76. Resultados métodos
Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos
negativos
Definiciones del ejemplo

77. Resultados método
Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
negativos
Definiciones del ejemplo

78. Evaluador de los requisitos deEvaluador de los requisitos de
CalidadCalidad
 Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos
categorías, (+)/(-) según el método, y establecen una tabla de
comparación respecto del resultado obtenido mediante el criterio de
exactitud diagnóstica analítica.
Criterio de exactitud diagnóstica
Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total
POSITIVOS VP FP VP + FP
NEGATIVOS FN VN FN + VN
Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN
*CLSI: EP12-A2

79. Tablas de ContingenciaTablas de Contingencia
 Las mas simples son las que diferencian las
muestras en dos categorías : positivo o
negativo.
 Luego se establece una tabla de
comparación respecto al resultado obtenido
con resultado de método de referencia .
 A partir de la tabla se calculan los cuatro
parámetros básicos : falsos+, falsos-,
sensibilidad y especificidad.

80. Ventajas:
 Son de fácil aplicación en la mayoría de los
bioensayos.
Desventajas:
o Dan una medida global de la capacidad del método.
o Se estima que la muestra se comportará
estadísticamente de forma similar a las ya
analizadas.
o No se calcula una probabilidad de error en cada
muestra en particular.
o La capacidad de la tabla depende del número de
muestras analizadas.
Tablas de ContingenciaTablas de Contingencia

81.  Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero
(positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale
decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B.
P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b)
P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b)
P(a): prob. de obtener un resultado positivo
P(b): prob. de obtener un resultado negativo
P(p/a): prob. de obtener un resultado (+)
cuando esta presente la enfermedad.
P(p/b): prob. de obtener un resultado (+)
cuando no esta presente la enfermedad.
Evaluador de los requisitos deEvaluador de los requisitos de
CalidadCalidad

82.  Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de
Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en la
sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificación que se
haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de decisión clínica
para un analito determinado.
* A. Pulido, I. Ruisánchez, R.
Boqué , F.X. Rius
Evaluador de los requisitos deEvaluador de los requisitos de
CalidadCalidad

83. Sensibilidad vs. Especificidad.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
ESPECIFICIDAD (Fracción verdaderos
negativos)
SENSIBILIDAD
(Fracciónverdaderospositivos)
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
1-ESPECIFICIDAD (Fracción falsos
positivos, FFP)
SENSIBILIDAD
(Fracciónverdaderospositivos)
Sensibilidad vs. 1- Especificidad.

84. Lectura de las Curvas ROCLectura de las Curvas ROC
* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/

85. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UNPROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICOMÉTODO ANALÍTICO
- Identificación
-Titulo
-Protocolo redactado por
-Protocolo aprobado por
-Objetivo -Alcance
-Factores críticos
-Selección y tratamiento muestra y MRC
-Identificación equipo: certificado calibración
-Método analítico: PON
-Variables a determinar : análisis estadístico
-Personal que desarrollará la validación
-Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño
-Conclusiones
-Registros -Referencias

86. INFORME DE VALIDACIÓN DE UNINFORME DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICOMÉTODO ANALÍTICO
-Identificación
-Titulo
-Informe redactado por
-Informe aprobado por
-Objetivo -alcance
-Responsabilidad
-Equipo, materiales, documentos
-Procedimiento
-Cálculos y análisis estadísticos
-Criterio de aceptación vs Resultados
-Informe de desviaciones
-Informe resultados y conclusiones de
validación del método