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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
SECCION CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

MANUAL DE LABORATORIO DE
ANALISIS BIOQUÍMICO CLINICOS I

AUTORES:
Q.F.B. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEON
Q.F.B. RENE DAMIAN SANTOS
M en C GLORIA LETICIA ARELLANO MARTNEZ
Q.F.B. MA. DE LOURDES GALVAN RUIZ
Q.F.B. BEATRIZ LUCIA GONZALEZ MALDONADO
Q.F.B. OMAR ASAF RUIZ CAZARES

AGOSTO DE 2008

ÍNDICE
Pág
Presentación 2
Reglamento de Laboratorio 3
Practica No. 1. Toma de muestra de sangre venosa 5
Practica No. 2. Citometría hemática 14
Practica No. 3. Grupos sanguíneos y pruebas cruzadas 25
Practica No. 4. Pruebas de coagulación 33
Practica No. 5. Química sanguínea I y glucosa posprandial 43
Practica No. 6. Química sanguínea II 51
Practica No. 7. Urianálisis 59
Referencias 70

1

PRESENTACION
En este manual se presenta la información necesaria para realizar adecuadamente las
prácticas de la asignatura de Análisis Bioquímico Clínicos I, además de formar parte
del material de consulta para los estudiantes y aplicar a los estudiantes que se
encuentren cursando la asignatura de Análisis Bioquímico Clínico I y a los profesores
que participen en esta asignatura. El manual fue elaborado por los profesores que
participan en la asignatura.
El manual consta de 7 prácticas, que están organizadas en 10 puntos, que a
continuación se resumen, para mejor comprensión del manual.
1. Marco teórico. En el se da un panorama de la importancia del estudio e incluye una
sección denominada información complementaria, que comprende una serie de
preguntas o temas que el alumno debe responder previo a la realización de la
práctica.
2. Objetivo u objetivos de la práctica.
3. Materiales. Este punto incluye un listado del material requerido por equipo de
trabajo y por grupo, los reactivos necesarios para la práctica, así como la muestra
biológica requerida para la misma.
4. Métodos. En este apartado se desglosan las determinaciones que se realizarán
durante la sesión experimental. Cada determinación incluye su fundamento, el
significado clínico y el procedimiento a seguir.
5. Disposición de residuos. Se índica la forma de desechar los residuos generados
durante la práctica.
6. Diagrama de flujo. Consiste de una hoja en blanco en la que el alumno plasmara
en forma de diagrama la secuencia a seguir en la sesión experimental.
7. Resultados. En algunas prácticas este punto viene desglosado por cálculos
aritméticos y una tabla de resultados, en la cual se deben incluir el valor de
referencia y la interpretación de los resultados.
8. Discusión. Este apartado se incluyo con el fin de que alumno plasme en el mismo
manual su análisis y discusión de resultados, evitando el manejo de otras libretas.
9. Conclusiones. Tiene la misma intención del punto 8.
10. Referencias consultadas. Es un punto en el cual el alumno deberá anotar las
referencias que empleo para realizar su discusión y elaborar sus conclusiones.
Se ha incluido también en el manual, el reglamento del laboratorio, que se ha ubicado
al inicio del manual, con la finalidad de que el alumno lo tenga siempre a la mano y
recuerde cuales son los lineamientos que debe seguir en el laboratorio, para un mejor
desarrollo de las prácticas.
Los Profesores de la Asignatura

2

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CODIGO: DOC-CB-FESC-
REGLAMENTO GENERAL DEX-01-00
PARA LOS LABORATORIOS o
N de REVISIÓN:

1) Este reglamento aplicará para personal académico, alumnos y laboratoristas.

2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con
manga larga.

3) La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos
a partir de la hora señalada.

4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante
las prácticas.

5) En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de
trabajo.

6) Queda prohibido en los laboratorios:
a) Tirar basura fuera del cesto.
b) Ingerir alimentos y/o bebidas.
c) Fumar.
d) Recibir visitas.
e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.
f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.
g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental.
h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.
i) Mover el mobiliario de su lugar.
j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la
asignatura.

3

7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados
para tal fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias,
compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado físico
representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por
sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o
biológico-infecciosas (Art. 3º de la Ley General del Equilibrio y Protección del
Ambiente).

8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares,
reproductores de sonido o cualquier medio electrónico de entretenimiento.

9) El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente un
profesor.

10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deberá programarse con el
responsable del laboratorio en un horario que no interfiera con aquel destinado
para el desarrollo de las prácticas. para solicitar material y equipo, es requisito
indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CB-
DEX-01-09/CSH-a) y lo entregue a la persona responsable, dejando como
depósito la credencial vigente de la UNAM.

11) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo
indicando cualquier anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en
las condiciones en que se recibió, de no hacerlo, se hará acreedor a las
sanciones establecidas en cada laboratorio.

12) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el
laboratorio.

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PRACTICA No. 1

TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA
Patricia Campos P.

1.1 MARCO TEÓRICO

El volumen total de sangre en un adulto es 7 a 8% de su peso corporal; siendo el 55%
la porción líquida llamada plasma cuya composición corresponde fundamentalmente
90 % agua y el 10 % diferentes metabolitos. El 45% restante de la sangre se compone
de elementos celulares eritroides, plaquetarios y leucocitarios.
Para que una muestra tenga significado biológico, debe ser representativa y
homogénea, por lo que se debe tener conocimiento sobre:
- La distribución y concentración de cada metabolito en los diferentes tipos de
líquidos orgánicos.
- Estado biológico del metabolito a estudiar (si está libre o conjugado).
- La producción, utilización y regulación homeostática.
Debe recordarse que una muestra de sangre nos va a reflejar el perfil biológico del
paciente del momento en que se ha efectuado la extracción.
Existen diferentes técnicas de extracción de muestra sanguínea
- Punción venosa
- Punción capilar
- Punción arterial
Para tomar la decisión de cuándo usar cada una de estas técnicas se debe considerar
los siguientes factores:
- Edad del paciente
- Condiciones del paciente
- Tipo de pruebas a realizar
La técnica de venopuncion, como esta descrita en la estandarización, contempla
desde:
- Condiciones inherentes del paciente (peso, edad, vena no visible, hospitalizado)
Selección del material
- Posición de la toma
- Selección del sitio de punción
- Punción venosa (preferentemente con sistema de punción al vació)
- Eliminación de punzo cortantes

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Las venas más comúnmente utilizadas son las del área ante cubital (vena basílica,
cefálica y cubital media), debido a su accesibilidad, fácil manejo y comodidad para el
paciente. La venopunción es la más utilizada en el laboratorio clínico ya que es un
método sencillo para la obtención de sangre, esta suele hacerse en la vena media
cefálica que corre por el interior del brazo y es visible en el pliegue del codo. En casos
en los cuales resulta difícil localizar la vena, puede hacerse resaltar diciendo al
paciente que cierre y abra la mano, mediante el masaje o por combinación de ambos
procedimientos. Se puede realizar de una manera accesible en la mayoría de los
pacientes ambulatorios o de consulta externa y en algunos pacientes hospitalizados.
La aplicación del torniquete es recomendada para el caso de venas profundas, poco
visibles y poco palpables. Debe sujetarse con medio nudo para que pueda quitarse
jalando el extremo libre. Para su colocación, es necesario considerar que se ubique 10
cm. por encima del lugar de punción; si se coloca más alto no hay presión, mientras
que si está cerca de la zona de punción hay posibilidad de generar un hematoma;
además no debe estar más de un minuto en lugar de punción. Se ha demostrado que
la utilización del torniquete durante un tiempo mayor a 1 minuto, provoca aumento de
un 15% de desviación en valores de coagulación y de un 10% en el hematocrito.
Los anticoagulantes son sustancias que impiden la coagulación sanguínea, ya sea por
sustracción del calcio del plasma o por neutralización de la trombina. Cuando la
sangre se obtiene agregando algún anticoagulante, se inhibe la cascada de la
coagulación obteniendo, después de la centrifugación, elementos formes separados
del sobrenadante que se conoce como plasma. En cambio, si se permite que la
muestra coagule, se obtendrá coágulo y el sobrenadante se llama suero.
La sangre desfibrinada es aquella desprovista de factores de la coagulación.

1.1.1 Información Complementaria
- Indique ejemplos de anticoagulantes, su modo de acción, su concentración y
proporción en que se usa para esta función.
- ¿Cual es la diferencia entre suero y plasma? Considere su composición y la
metodología para su obtención
- ¿Que es la hemólisis? Mencione algunas recomendaciones para evitarla
- ¿Que se obtiene de la técnica para la sangre desfibrinada después de la
centrifugación?
- Indique como se observa una muestra sanguínea lipémica y cual es la razón

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1.2 OBJETIVOS
- El alumno adquirirá los conocimientos necesarios a para poder realizar una
venopunción
- El alumno desarrollara la habilidad práctica por medio de la técnica de la
venopunción para poder obtener una muestra de sangre venosa con calidad e
integridad.
- El alumno conocerá la importancia e influencia de la buena toma de muestra
sanguínea a través de los conocimientos y practica adquiridos para poder llevar a
cabo un correcto diagnóstico y una toma de decisiones terapéuticas adecuada.

1.3 MATERIAL
1.3.1 Muestra Biológica
Se utilizarán tres muestras de sangre venosa: 3 ml y 10 ml obtenidos con jeringa, 7 ml
obtenidos con tubo al vacío.

1.3.2 Material por equipo

1 Gradilla 10 Perlas de vidrio
4 Tapón para tubo de ensaye 13 x 100 1 Propipeta
4 Pipetas pasteur 1 Adaptador para tubos al vacío
3 Bulbo para pipeta Pasteur 1 Piseta con agua destilada
8 Tubo de ensaye 13 x 100 6 Gasas
1 Tapa o base para caja petri 1 Tubo 12x75 con 1 ml de EDTA
1 Tubo de ensaye 15x150 con tapón de rosca 5%

1.3.3 Material por grupo
Aplicador de madera Contenedor para punzocortantes
Aguja para tubo al vacío Vaso de precipitado de 250 mL
Tubo al vacío con gel separador Gradilla
Torundas de algodón con alcohol al 70 % Pisetas con agua destilada
Gasas Recipiente para desechos (RPBI)
Cuadros de papel parafilm Micropipetas 5 a 40 l
Balanza granataria de dos platos Pipeta graduada de 1 mL (1/100) con
Frasco con agua corriente y una jeringa propipeta
Centrifuga Baño de incubación a 37º C con
Espectrofotómetro con gradilla y 10 celdas gradilla y termómetro
limpias Brazos artificiales con solución cada
uno con jeringa Tubo al vacío con
Aguja

1.3.4 Reactivos por grupo

EDTA al 5% Hipoclorito de sodio
Alcohol al 70% Benzal
Agua destilada

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1.4 METODOS

1.4.1 Técnica de venopunción por vacío
Para la extracción de sangre el paciente estará sentado y deberá apoyar bien el brazo
en una superficie plana, no debe estar de pie o sentado en bancos altos, pues algunos
por el efecto de la punción se desmayan y es necesario considerar este riesgo.
La técnica de venopunción que se esquematiza a continuación es la indicada para el
sistema al vacío:
a) Preparar el material. (Romper el sello de seguridad de la aguja sin quitar el
protector de la misma en presencia del paciente. Colocarlo en el adaptador).
b) Localizar la vena con el dedo índice y/o medio, evitar utilizar el pulgar.
c) Limpiar la zona con alcohol isopropílico al 70% de manera circular del centro hacia
fuera. Dejar secar al aire.
d) Solo si es necesario aplicar un torniquete.
e) Sujetar la parte posterior del brazo del paciente a nivel del codo, jalar ligeramente
la piel sobre la vena.
f) Punción en ángulo de 45º insertando primero la aguja con el bisel hacia arriba
colocándola paralela al trayecto de la vena y posteriormente insertar el tubo
(respetando el orden de la toma).
g) Retirar la ligadura en cuanto la sangre empiece a fluir (si es necesario).
h) Dejar llenar el tubo hasta el volumen preestablecido (frecuente error preanalítico,
que afecta la relación sangre anticoagulante y por lo tanto la calidad de la
muestra).
i) Mezclar suavemente los tubos con anticoagulantes o aditivos.
j) Insertar el siguiente tubo en el caso de toma múltiple.
k) Cuando se finaliza la toma, primero se debe retirar el tubo y posteriormente la
aguja.
l) Presione el sitio de la venopunción con una torunda con alcohol y coloque un
apósito adhesivo elástico.

1.4.2 Técnica de venopunción con jeringa.
Seguir los pasos a, b, c, d y e del procedimiento 1.4.1
e) Quitar el tapón de plástico de la jeringa cuidando que el bisel de aguja se encuentre
hacia arriba colocarla en ángulo de 45º y paralela al trayecto de la vena.
f) Perforar la piel a lo largo de la cara lateral de la vena, avanzar la aguja y perforar la
pared de la vena.

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g) Al subir espontáneamente la sangre (se observa una ligera gota en la cubeta de la
aguja) jalar ligeramente el émbolo con movimiento constante.
h) Cuando se tiene suficiente cantidad de sangre, se quita el torniquete, se retira la
aguja rápidamente y se aplica una torunda por último un apósito adhesivo elástico.
i) Para el manejo de la muestra obtenida con jeringa se retira la aguja de la jeringa y
la sangre se vacía lentamente por la pared de los diferentes tubos a usar con y/o sin
anticoagulante. Mientras se llenan los tubos sucesivamente, invertir con suavidad los
tubos con aditivos que ya se han llenado

1.4.3 Obtención de Plasma
La sangre obtenida por punción venosa con jeringa (3 ml) se vacía inmediatamente en
el tubo con la cantidad adecuada de anticoagulante. Es importante recordar quitar la
aguja para vaciar el contenido de la jeringa.
Se mezcla por inversión lenta con el anticoagulante, evitando la formación de burbujas
y se centrifuga a 2.500 rpm/ 5 - 10 min.
El tubo se saca de la centrifuga y se separa cuidadosamente el plasma con una pipeta
Pasteur, vaciándolo en otro tubo.
El plasma también se puede obtener por el método de tubo al vacío, el cual puede
contener dos diferentes anticoagulantes, EDTA al 5 % (tubo de tapón lila) o citrato
sódico al 3,8 % (tubo de tapón azul), que se elegirá dependiendo de las
determinaciones que se realizarán a la muestra.

1.4.4 Obtención de Suero
La muestra de sangre obtenida con tubo al vacío de tapón rojo, se coloca en forma
inclinada (mayor superficie de contacto) en el baño de incubación a 37º C durante 10
minutos.
El coagulo (observe la retracción si se presenta), se separa ligeramente de las
paredes con un aplicador de madera, y se centrifuga a 2.500 rpm/5 - 10 min. El tubo
se retira de la centrifuga y se separa el suero con pipeta Pasteur, vaciándolo en otro
tubo de ensayo.
El suero también puede obtenerse tomando la muestra con jeringa y depositándola en
un tubo de ensayo sin anticoagulante.

1.4.5 Obtención de sangre desfibrinada
La muestra de sangre venosa obtenida con jeringa se vacía en un tubo con tapón de
rosca que contenga al menos el mismo número de perlas de vidrio que mililitros de
sangre se vaya a desfibrinar. A continuación se aplica un movimiento de inversión

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suave del tubo constante. Al cabo de 2-3 minutos se observará que el ruido que las
perlas hacían al chocar contra las paredes del tubo, deja de oírse, eso se debe a que
la fibrina que se va formando en el proceso de la coagulación, se deposita sobre ellas,
atrapándolas. A partir de ese momento se prosigue el movimiento rotatorio durante 10
minutos. Posteriormente se separan con mucho cuidado la sangre líquida en un tubo
de ensaye que se lleva a centrifugar y las perlas de vidrio en la tapa o base de una
caja Petri las cuales se lavan con agua destilada separando la fibrina que se adhirió a
ellas. La sangre líquida se centrifuga a 2.500 rpm/5 - 10 min.

1.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
1.5.1 Eliminación de punzocortantes
La eliminación de punzocortantes adecuada es parte importante de la toma de
muestra. En este caso la eliminación de aguja de toma múltiple, está de acuerdo a
normas nacionales (NOM-087-ECOL-SSA1-2002) y las políticas de buenas prácticas
establecidas en cada laboratorio.
Los punzocortantes como agujas y lancetas así como tubos rotos contaminados deben
depositarse en el contenedor rojo rígido.
En los contenedores existen diferentes capacidades, lo cual permite que el laboratorio
seleccione el más adecuado a su flujo de trabajo y material utilizado. Se debe tomar
en consideración las instrucciones de utilización recomendadas por los fabricantes y
cuidar no sobrellenar el contenedor, pues esto puede ser un factor de riesgo para el
personal técnico y de intendencia.
Con una adecuada eliminación se disminuyen los eventos de punción accidental tanto
para el paciente y trabajador de salud, como para el personal de intendencia.

1.5.2 Eliminación de muestras biológicas
Los tubos para extracción de sangre contaminados o llenos tienen que recogerse en
recipientes apropiados para residuos de material potencialmente infeccioso que en
este caso son bolsas rojas.
Los tubos de vidrio que contengan las muestras serán colocados en agua con cloro
durante 24 h.
La eliminación de residuos se hace usualmente en instalaciones incineradoras
apropiadas.

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1.6 DIAGRAMA DE FLUJO

11

1.7 RESULTADOS
1.7.1 Cálculos

1.7.2 Tabla de Resultados

Datos Paciente Puncionó Técnica(c/s Muestra Observaciones
anticoagulante) obtenida

12

1.8 DISCUSIÓN

1.9 CONCLUSIONES

1.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

13

PRÁCTICA No. 2

CITOMETRÍA HEMÁTICA

2.1 MARCO TEÓRICO.
Aunque existe la tendencia a la automatización en la citometría hemática, la presente
práctica está diseñada para introducir al estudiante en los procedimientos de
laboratorio manuales que puede ser necesario utilizar cuando existen recuentos que
exceden la linealidad de un instrumento o éste presenta un desperfecto.
El método de cianometahemoglobina para la determinación de hemoglobina y el
microhematocrito que permite medir el volumen de los eritrocitos centrifugados, se
usan como parte del control de calidad y como métodos de apoyo de análisis de varios
laboratorios.
El hemocitómetro permite realizar recuentos de cualquier tipo de célula sanguínea:
eritrocito, leucocito o plaqueta que ayudan a detectar anormalidades cuantitativas, que
al hacer un frotis sanguíneo, teñirlo con colorante de Wright y observarlo al
microscopio permite identificar las alteraciones morfológicas o en el caso de los
leucocitos el tipo celular que predomina.
Empleando los resultados del recuento eritrocitario, valor de hematocrito y
concentración de hemoglobina se calculan los índices eritrocíticos (índices de
Wintrobe), que aportan datos importantes sobre el tamaño, la concentración de
hemoglobina y el peso de hemoglobina de un eritrocito promedio. Datos que facilitan el
diagnóstico y la clasificación de las anemias.
El recuento de reticulocitos permite evaluar la actividad eritropoyética de la médula
ósea, se hace utilizando tinciones supravitales.
La velocidad de sedimentación globular (VSG), mide la sedimentación de los
eritrocitos en un periodo de 1 hora, que es dependiente de las sustancias contenidas
en el plasma y la capacidad de las células para sedimentar. Se encuentra alterada en
procesos inflamatorios y se usa para monitorear el tratamiento de ciertas
enfermedades.
Los resultados obtenidos con estos procedimientos se usan en el diagnóstico para la
identificación de afecciones que incluyen: anemias, leucemias, infecciones, así como,
trastornos hereditarios de los leucocitos; y además son útiles para el pronóstico y
vigilancia terapéutica de diversos padecimientos.

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2.1.1 Información complementaria.
- ¿Cuáles son las instrucciones que se dan a un paciente a quien se le realizará una
citometria hemática?
- Justificar matemáticamente y señalar c/u de los factores a considerar en la obtención
del factor 36,8 utilizado para calcular la concentración de hemoglobina y sus unidades.

2.2 OBJETIVOS
El alumno aplicará los conocimientos adquiridos en la parte teórica, para realizar una
citometria hemática.
El alumno interpretará los resultados obtenidos en el laboratorio a fin de establecer la
presencia o no de anemia.
El alumno aprenderá a identificar la morfología de las diferentes células sanguíneas
con fines diagnósticos.

2.3 MATERIALES
2.3.1 Muestra biológica.
Sangre venosa completa obtenida por sistema de vacío con EDTA.

Gradilla Tubo de Wintrobe
Tubo de ensaye 13 x 100 Hemocitómetro
Tubo de ensaye 12 x 75 Adaptador para tubos al vacío
Pipeta de Salhi con manguera de Tubos de ensaye 12x75 con 3 ml de SSF,
succión 3ml de reactivo de Turck, 3ml de reactivo
Contador de Hayem cada uno
Pipeta Pasteur con punta larga con
bulbo
Microscopio

2.3.3 Material Por Grupo
Tubo capilar Celdas /2 gradillas
Aguja para tubo al vacío Pipeta graduada de 5 ml c/propipeta
Tubo al vacío de tapón lila Gradillas de Sedimentaciòn
Torundas de algodón con alcohol al 70 % Pisetas de agua destilada
Gasas Vasos de pp de 250 ml
Tubo al vacío con tapón lila Viales limpios c/2 -3 ml de EDTA al 5%
Cuadros de papel parafilm Vortex
Microcentrífuga Recipiente c bolsa roja para desechos
Lector de hematocrito Contenedor para punzocortantes
Espectrofotómetros con vaso de precipitado Frascos torunderos c/torundas y alcohol
de 500 ml

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2.3.4 Reactivos
Reactivo de Drabkin (Hemoglobina) Benzal
Etanol 70% Hipoclorito de sodio
Líquido de Turck Reactivo de Wright
Reactivo de Hayem Buffer de fosfatos para tinción de Wright
Cloruro de sodio 0,9% (SSF) Azul de cresilo brillante

2.4 MÉTODOS
2.4.1 Hemoglobina: Método de la cianometahemoglobina
Fundamento. Para la determinación de hemoglobina se utiliza el reactivo de Drabkin,
el cual contiene un detergente que permite la lisis de los eritrocitos y, por lo tanto la
liberación de la hemoglobina. Posteriormente, el ferricianuro de potasio la reduce a
metahemoglobina, que se estabiliza por la unión con los iones CN- (cedidos por el
KCN) formando cianometahemoglobina que tiene una absorbancia máxima a 540 nm.
Significado clínico. El valor de referencia de la hemoglobina para mujeres es de 12 a
16 g/dl y para hombres de 14 a 18 g/dl. La disminución de hemoglobina indica anemia,
que puede deberse a deficiencia en las sustancias que intervienen en su formación,
alteraciones en los órganos que la sintetizan y disminución en la producción o
destrucción excesiva de los eritrocitos.
Procedimiento.
- Colocar 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo 13x100
- Llenar la pipeta de Sahli hasta la marca de 20 con ayuda una boquilla.
- Secar el exceso de sangre con una gasa limpia.
- Sin dejar caer alguna gota de sangre, depositar la muestra en el tubo con el
reactivo de Drabkin, enjuagando la pipeta con un poco del reactivo.
- Tapar el tubo con papel parafilm. Homogenizar la preparación en un vórtex.
- Incubar 3 minutos a temperatura ambiente.
- Leer a 540 nm antes de 5 minutos. Multiplicar la absorbancia obtenida por 36.8
para obtener la concentración de hemoglobina en g/dl.

2.4.2Cuenta de eritrocitos: Método del hemocitómetro
Fundamento. El número de células por mm3 estará determinado por un factor de
dilución en la pipeta de Thoma para eritrocitos, por el conteo de las cinco cuadrículas
secundarias del hemocitómetro y por el volumen de la cámara. Las células contadas
en el objetivo 40X corresponderán a los eritrocitos después de un tratamiento con el
diluyente de Hayem, compuesto de bicloruro de mercurio, sulfato de sodio y cloruro de
sodio, que permite la lisis de los leucocitos, y conservar a los eritrocitos en un
ambiente isotónico.

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Significado clínico. El valor de referencia para hombres es de 4,0 – 6,2 x 106 células /
mm3, el de mujeres es de 4,0 – 6,2 x 106 células / mm3. El aumento de eritrocitos se
observa en la hemoconcentración, en afecciones del bazo. Su disminución se
manifiesta en las anemias, cuyo origen puede ser la pérdida excesiva de sangre,
destrucción acelerada o producción inadecuada de eritrocitos.
Procedimiento.
- Llenar la pipeta de Thoma para eritrocitos (roja) con sangre hasta la marca de
0.5 con ayuda una boquilla.
- Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el líquido diluyente de Hayem
hasta la marca de 101 sin pasar de la marca.
- Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm.
- Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min.
- Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitómetro.
- Contar las células con el objetivo 40X en las cinco cuadrículas secundarias con
la ayuda de un contador mecánico.
- Calcular el número de eritrocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por
10000.

2.4.3 Hematocrito: Método del Microhematocrito
Fundamento. El hematocrito expresa en porcentaje (%) el volumen que ocupan los
eritrocitos en una muestra sanguínea centrifugada en velocidad y tiempo constante.
Significado clínico. El valor de referencia es de 37 a 47% en mujeres y 42 a 52% en
hombres. Su aumento indica policitemia (aumento del número de eritrocitos); su
disminución se presenta durante la anemia, hipovolemia y durante el embarazo.
Procedimiento.
- Llenar un capilar de 75 mm hasta ¾ partes por capilaridad con la sangre
previamente homogenizada.
- Sellar el extremo vacío del tubo con un encendedor.
- Colocar el tubo capilar sellado en la microcentrífuga con la parte sellada hacia
el lado opuesto al centro de la centrífuga.
- - Centrifugar 5 minutos (10.000 rpm) o 10 minutos (5.000).
- Calcular el microhematocrito con ayuda del lector de microhematocrito o de
acuerdo a la siguiente fórmula:
- Hto= Vol. de eritrocitos (mm) / Vol Total de sangre (mm) x100
- Reportar en %.

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2.4.4 Índices de Wintrobe: VCM, HCM, CHCM
Fundamento. Se trata de indicadores obtenidos mediante cálculos aritméticos, que
involucran los valores de hemoglobina, número de eritrocitos/mm3 y hematocrito, y que
permiten la clasificación morfológica de las anemias.
Significado clínico. Los valores de referencia son:
- VCM = 80 – 100 fl; un valor < 80 fl indica anemia microcítica; mientras que por
arriba de 100 fl indica anemia macrocítica. Esta relacionada con la anisocitosis.
- HCM = 26 a 34 pg y CHCM = 32 – 36 g/dl; valores menores al de referencia
indican anemia hipocrómica; mientras que valores por arriba del límite de
referencia indican anemia hipercrómica.
Procedimiento.
Para obtener los índices de Wintrobe es necesario tener los valores de hemoglobina,
número de eritrocitos/mm3 y hematocrito, utilizando las siguientes fórmulas.
Volumen Corpuscular Medio (VCM) = Hto / No. eritrocitos X 10 = [fl] (femtolitros)
Hemoglobina Corpuscular media (HCM) = Hb / No eritrocitos. X 10 = [pg] (picogramos)
Concentración de HCM (CHCM) = Hb / Hto X 100 = [g/dl]

2.4.5 Cuenta de Reticulocitos: Tinción supravital
Fundamento. Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de
rRNA (ácido ribonucleico ribosomal). Cuando son sometidos a colorantes llamados
supravitales, como el azul de cresilo brillante, este precipita sobre los restos de rRNA
permitiendo observarlo en forma de “cuentas de rosario”, que los eritrocitos maduros
no contienen.
Significado clínico. El valor de referencia es de 5 a 20 reticulocitos/1.000 eritrocitos o
0,5 a 2,0 %. Cuando se presenta la destrucción acelerada de eritrocitos (anemia
hemolítica, sangrado excesivo, hemorragia), el número de eritrocitos aumenta.
Procedimiento.
- Colocar en un tubo 12x75, 5 gotas de colorante azul de cresilo brillante
- Adicionar 5 gotas de sangre homogenizada.
- Mezclar sin agitar ni generar burbujas.
- Incubar 15 minutos a temperatura ambiente,
- Con esta preparación realizar un frotis y dejarlo secar al aire.
- Observar con el objetivo de 100X, buscando una zona de la extensión donde el
número de eritrocitos sea aproximadamente 100, contando el número de
reticulocitos presentes.
- Repetir el conteo en al menos en tres campos distintos. Expresar el número de

18

reticulocitos observados por cada mil eritrocitos o en tanto por ciento.

2.4.6 Cuenta de leucocitos: Método del hemocitómetro
Fundamento. El número de células por mm3 estará determinado por un factor de
dilución en la pipeta para glóbulos blancos, por el conteo de las cuatro cuadrículas
primarias del hemocitometro y por el volumen de la cámara. Las células contadas en el
objetivo 10X corresponderán a los leucocitos después de un tratamiento con el
diluyente de “Turck”, compuesto de ácido acético glacial, que lisa a los eritrocitos, y
azul de metileno (colorante de contraste) que permite observar fácilmente a los
leucocitos. La fuerte agitación es importante para este cometido.
Significado clínico. El valor de referencia es 5.000 a 10.000 leucocitos/mm3. Los
leucocitos son células de la defensa (inmunidad) que incrementan en procesos
inflamatorios o infecciosos. Su disminución se observa durante la inmunosupresión
(por el usos de fármacos), inmunodeficiencia (algunos virus pueden ocasionarla) o en
la leucopoyesis alterada.
Procedimiento.
- Llenar la pipeta de Thoma para leucocitos (blanca) con sangre hasta la marca
de 0.5 con ayuda de una boquilla.
- Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el líquido diluyente de Turck
hasta la marca de 11 sin pasar de la marca.
- Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm.
- Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min.
- Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitómetro.
- Contar las células con el objetivo 10X en las cuatro cuadrículas primarias con
la ayuda de un contador mecánico.
- Calcular el número de leucocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por 50.

2.4.7 Cuenta diferencial de leucocitos: tinción de Wright
Fundamento. La extensión de la sangre sobre un portaobjetos (frotis) permite apreciar
mejor la morfología de las células sanguíneas. El conteo diferencial es posible gracias
a la tinción de Wright, cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de
color azul las partes ácidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas)
disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la
preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición al
metanol). De esta manera, es posible realizar la cuenta diferencial de las poblaciones
leucocitarias, además de observar la morfología y características de tinción de los

19

eritrocitos y plaquetas.
Significado clínico. El valor de referencia relativo y las alteraciones comunes de las
células leucocitarias son las siguientes:
- Neutrófilos segmentados = 45 a 60%; la neutrofilia se observa durante
procesos inflamatorios agudos e infecciosos; la neutropenia se presenta en la
depresión de la médula ósea, inmunodeficiencia o inmunosupresión.
- Linfocitos = 20 a 40%; la linfocitosis se manifiesta en alteraciones virales y en
respuesta a procesos infecciosos; la linfopenia se observa en procesos
similares a la neutropenia.
- Monocitos = 0 a 7%; la monocitosis
- Neutrófilos en banda = 0 a 5 %; su número se observa incrementado cuando
los neutrófilos segmentados disminuyen por reaccionar ante el agente
infeccioso.
- Eosinófilos = 0 a 4%; la eosinofilia se presenta principalmente en respuesta a
cuadros alérgicos y durante las parasitosis.
- Basófilos = 0 a 1%; la basofilia se manifiesta cuando los eosinófilos aumentan,
pues se trata de células que controlan la respuesta alérgica.
Como se mencionó, en el frotis sanguíneo también se observan las plaquetas (forma y
tamaño) y los eritrocitos, cuyas observaciones deben relacionarse a lo determinado
por los índices de Wintrobe, de acuerdo a lo siguiente:
 Anisocitosis: diferentes tamaños del eritrocito; siendo un microcito si su tamaño
es menor 7 m; normocito si va de 7 a 8 m y macrocito si es mayor a 8 m.
Esta característica se relaciona con el VCM.
 Anisocromía: diferentes características de tinción; es hipocrómico si se tiñó
débilmente; normocrómico si tiene una coloración normal e hipercrómico si su
tinción es intensa. Esta característica se relaciona con el HCM y CHCM.
 Poiquilocitosis: cambios permanentes en la forma del eritrocito. No mantiene
relación con los índices de Wintrobe.
Procedimiento.
- Colocar una gota de sangre perfectamente homogenizada en un portaobjetos.
- Hacer la extensión de sangre con un movimiento suave y firme con la ayuda de
otro portaobjetos.
- Secar al aire.
- Cubrir el frotis completamente con colorante de Wright durante 7 minutos
(cuidar que no se seque el colorante).
- Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos.

20

- Decantar y enjuagar con agua destilada.
- Contar al microscopio en el objetivo de 100X, 100 células leucocitarias con
ayuda de un contador mecánico. Al mismo tiempo que se recorre el frotis
observar la morfología de eritrocitos y plaquetas.

2.4.8 Velocidad de sedimentación globular: Método de Wintrobe
Fundamento. La velocidad de sedimentación globular (VSG) está determinada por la
propiedad de sedimentación de las células sanguíneas por influencia de la gravedad y
depende de las características del plasma y su relación con las células.
Significado clínico. El valor de referencia para hombres es 0 a 15 mm/h y para
mujeres es 0 a 20 mm/h. Si la VSG está aumentada se demuestra la presencia de
inflamación o destrucción celular, como en el caso de lupus eritematoso generalizado,
artritis reumatoide, infecciones crónicas y agudas, fiebre reumática, hepatitis, infarto al
miocardio, embarazo, menstruación.
Procedimiento.
- Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentación cuidando que esté
perfectamente bien nivelada.
- Con la ayuda de la pipeta Pasteur llenar el tubo de Wintrobe hasta la marca de
10 ó 1 con sangre previamente homogenizada.
- Dejar reposar durante una hora evitando cualquier movimiento.
- Hacer la lectura de los milímetros (mm) sedimentados en una hora.


Los tubos con sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores
dispuestos para cada fin.
Las agujas se desecharán en el contenedor rojo de punzocortantes.
Los guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminado con sangre
se depositarán en la bolsa roja de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI).
Los empaques de jeringas, agujas, guantes, algodón e incluso los mismos guantes, se
desecharán en el bote de la basura si no están contaminados con muestra biológica.

21


22

2.7 RESULTADOS
2.7.1 Cálculos

2.7.1 Tabla
Datos del Paciente
Nombre______________________________________ Edad______ Sexo____

Determinación Resultado Valor de Referencia Observaciones
Hemoglobina
Hematocrito
VSG
Eritrocitos
HCM
VCM
CMHC
Reticulocitos
Leucocitos
Neutrófilos
segmen.
Neutrófilos en
banda
Linfocitos
Monocitos
Basófilos
Eosinófilos

23

2.8 DISCUSIÓN

2.9 CONCLUSIONES

2.10 REFERENCIAS

24

PRÁCTICA No. 3

GRUPOS SANGUÍNEOS Y PRUEBAS CRUZADAS

Omar Ruiz C.

3.1 MARCO TEÓRICO
Las células sanguíneas contienen moléculas en la superficie de la membrana que
difieren de un individuo a otro. Las sustancias que se encuentran en los eritrocitos y
que son responsables de la incompatibilidad sanguínea, se han llamado antígenos
eritrocitarios y han sido descritos alrededor de 23 grupos diferentes. Estos diversos
antígenos forman a los grupos sanguíneos que son biomoléculas presentes al
nacimiento, cumplen con las leyes mendelianas y son detectadas porque reaccionan
específicamente con un anticuerpo.
El sistema ABO fue el primer grupo sanguíneo que se describió, son una secuencia de
5 a 7 carbohidratos y se encuentran en la membrana de los eritrocitos como
glicolípidos o en líquidos corporales como glicoproteínas. Lo constituyen los tipos A, B,
AB y O. Pero existen variantes como el antígeno Bombay y el antígeno de Lewis. Los
carbohidratos del sistema ABO sirven de transportadores de iones para los eritrocitos.
El factor Rh (de Macaccus rhessus, primate donde se descubrió al inocular sus
eritrocitos en conejos) es una lipoproteína transmembranal cuya sección reaccionante
es el antígeno D, aunque existen otros 43 antígenos más que lo componen, la
identificación de este antígeno describe un individuo Rh positivo. El Rh está
involucrado en la anemia hemolítica del recién nacido. Su papel fisiológico de la
lipoproteína es el transporte de iones con gasto de ATP.
Los sistemas ABO y Rh son los más estudiados debido a que son los más
inmunogénicos, es decir, que provocan una respuesta inmune más severa, tomando
gran importancia para el caso de transfusiones. Otros grupos sanguíneos que han
tomado importancia en el banco de sangre son el sistema Kell, Duffy, Kidd, Lutheran,
MN y Lewis.
Los grupos sanguíneos se estudian principalmente en los casos de transfusión o
trasplantes, en el estudio de estados hemolíticos inmunológicos; medicina forense,
exclusión de paternidad, homicidio, violaciones o en antropología física (origen o
migración étnica, mezcla racial).
Debido a la presencia de otros grupos sanguíneos, en el banco de sangre se emplean
las pruebas cruzadas. Dichas pruebas someten el plasma del receptor con eritrocitos
del donador y viceversa. Si existe alguna incompatibilidad sanguínea, será detectada
por una reacción antígeno-anticuerpo observándose en forma de aglutinación. La

25

reacción de aglutinación es utilizada también en la determinación de los grupos
sanguíneos.

3.1.1 Información complementaria
- ¿Qué es la eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido?
- Investiga cuál es la utilidad del suero de Coombs y la albúmina en la práctica.
- ¿Cuál es la secuencia de carbohidratos de los diferentes antígenos del sistema
ABO?
- Describe el proceso de preparación de 2 ml de suspensión de eritrocitos al 5%.
- Investiga los requisitos que debe cumplir el donante y otros análisis que se realizan
a la unidad de sangre donada.

3.2 OBJETIVOS
- El alumno conocerá la importancia de los grupos sanguíneos en el banco de
sangre através del estudio de incompatibilidades.
- El alumno determinará los grupos sanguíneos ABO y Rh de una muestra de
sangre a través de reacciones de aglutinación.
- El alumno analizará la compatibilidad de dos muestras para una transfusión a
través de las pruebas cruzadas.
- El alumno conocerá la utilidad del suero de Coombs con diferentes pruebas.

3.3 MATERIALES
3.3.1 Muestra biológica
Sangre venosa completa obtenida por sistema al vacío con EDTA
Suspensión de eritrocitos A al 5%
Suspensión de eritrocitos B al 5%

1 Placa de porcelana 1 Bulbo para pipeta Pasteur
8 Tubos de ensaye de 12 x 50 1 Pipeta graduada 1/100 de 1 ml
2 Tubos de ensaye de 13 x 75 1 Pipeta graduada 1/10 de 5 ml
2 Pipetas Pasteur 1 Vaso de precipitados de 100 ml
1 Adaptador para sistema la vacío 2 Tapones de goma para tubos de 13 x 75
1 Gradilla

Aplicadores de madera Balanza de doble plato
Agujas 21G x 1 frascos con agua
Centrífuga Vasos de precipitados de 500 ml
Tubos al vacío con EDTA Contenedor para punzocortantes
Lancetas Contenedores para biológicos
Baño maría a 37°C con 2 gradillas, 1 tubo y un infecciosos

26

termómetro Jeringa
Algodón

3.3.4 Reactivos
Suero hemotipificador Anti-A Solución salina fisiológica (SSF)
Suero hemotipificador Anti-B Albúmina al 22%
Suero hemotipificador Anti-D Alcohol etílico al 70%
Suero de Coombs

3.4 MÉTODOS
3.4.1 Tipificación Clásica
Fundamento. La tipificación clásica utiliza la reacción de aglutinación para observar si
existen los antígenos A y/o B en los eritrocitos. Si existe alguno de ellos, reaccionarán
específicamente con anticuerpos anti-A o anti-B que harán que aglutinar produciendo
una prueba positiva.
Significado clínico. Una aglutinación positiva indica la presencia del antígeno, ya sea
“A”, “B”, ambos (“AB”) o no aglutinación (“O”); así mismo, el antígeno indica el grupo
sanguíneo a la que pertenece la muestra.
Procedimiento.
- Colocar una gota de suero anti-A en un extremo de la placa.
- Colocar una gota de suero anti-B en otro extremo de la placa.
- Agregar una gota de sangre completa próximo a cada gota de suero.
- Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos
- Observar si existe o no aglutinación en menos de 2 minutos (se debe observar

3.4.2 Tipificación Inversa
Fundamento. Identifica los anticuerpos anti-A o Anti-B (también llamados
isoaglutininas) presentes en el suero o plasma de la muestra, los cuales reaccionan
específicamente con eritrocitos conocidos “A” o “B”.
Significado clínico. La presencia de aglutinación indica la presencia de anticuerpos
anti-A (si aglutina el tubo A) o anticuerpos anti-B (si aglutina el tubo B). El grupo
sanguíneo será “A” si sólo aglutina en el tubo B; grupo sanguíneo “B” si sólo aglutina
en el tubo A; “O” si aglutina en ambos y “AB” si no se encuentra aglutinación en
alguno de los tubos.
Procedimiento
- Colocar al tubo A 5 gotas de suspensión de eritrocitos A.
- Colocar al tubo B 5 gotas de suspensión de eritrocitos B.
- Agregar 5 gotas de suero o plasma problema a cada tubo.
- Incubar 15 minutos a 37°C, centrifugar a 2.000 rpm por 1 minuto.

27

- Observar si existe o no aglutinación moviendo un poco el fondo del tubo.

3.4.3 Antígeno D (Rh)
Fundamento. El antígeno D da una fuerte reacción de aglutinación con anticuerpos
anti-D determinando así el factor Rh como positivo.
Significado clínico. La aglutinación positiva indica una sangre Rh positiva, en el caso
contrario se deberá hacer la prueba de Du para asegurar que sea Rh negativa.
Procedimiento.
- Colocar una gota de suero anti-D en un extremo de la placa.
- Agregar una gota de sangre completa próximo a la gota de suero.
- Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos.
- Observar si existe o no aglutinación en menos de 5 minutos.

3.4.4 Detección del factor Du (solo si el Rh es negativo o dudoso)
Fundamento. Esta prueba se aplica cuando el Rh es negativo o dudoso en la prueba
de Antígeno D. El Rh está compuesto por varios determinantes antígénicos (C, D, E, c,
d, e) siendo el D el que da una mejor reacción. Para facilitar la aglutinación se agrega
suero de Coombs para detectar estos antígenos ya que reaccionan débilmente.
Significado clínico. Si existe aglutinación en el tubo con anti-D, la sangre es de la
variedad Du y es Rh positiva; El tubo con albúmina es el control negativo y no debe
existir aglutinación. Si ambos tubos no presentan aglutinación, la sangre es Rh
negativa.
Procedimiento.
- Colocar a cada tubo 1 gota de suspensión al 5% de eritrocitos problema. A un
tubo colocar una gota de suero anti-D y al otro una gota de albúmina
- Incubar ambos tubos a 37°C durante 15 minutos.
- Lavar 3 veces con SSF
- Después de decantar agregar a cada tubo 2 gotas de suero de Coombs
- Centrifugar a 2.000 rpm 1 minuto y observar si existe aglutinación moviendo
el botón.

3.4.5 Pruebas cruzadas
Fundamento. Estas pruebas determinan si existe compatibilidad sanguínea entre el
donante y el receptor a través de enfrentar sus sueros y eritrocitos en una prueba in
vitro. De esta manera se descartan anticuerpos irregulares y de otros grupos

28

sanguíneos diferentes al ABO y Rh que pudieran reaccionar al momento de la
transfusión.
Significado clínico. Después de agregar el suero de Coombs y no observar
aglutinación en ambos tubos hay compatibilidad del 100%. Si sólo existe aglutinación
en el tubo de la Prueba Mayor, existe un 75% de incompatibilidad; por otro lado si sólo
aglutina el tubo de la Prueba Menor, hay un 25% de incompatibilidad. La aglutinación
en ambos tubos indica 100% de incompatibilidad.
Procedimiento 1 (medio salino)
- Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensión de
eritrocitos del donador (Prueba Mayor).
- Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensión de
eritrocitos del receptor (Prueba Menor).
- Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto.
- Observar si existe aglutinación, de lo contrario incubar 15 min. a 37°C.
- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. Observar si hay aglutinación.
- Si no hay aglutinación o es dudosa, lavar 4 veces con SSF.
- Decantar, mezclar y agregar 2 gotas de suero de Coombs.
- Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm, 1 min. Observar aglutinación.
Procedimiento 2 (medio proteico).
- Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensión de
eritrocito del donador (Prueba Mayor).
- Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensión de
eritrocitos del receptor (Prueba Menor).
- Agregar 2 gotas de albúmina y seguir los pasos del 3 al 8 del procedimiento de
medio salino.
NOTA: los tubos en medio salino y medio proteico pueden realizarse
simultáneamente

Los tubos con sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores
dispuestos para cada fin.
Las agujas y lancetas usadas de desecharán en el contenedor rojo de punzocortantes.
Los sobrenadantes resultados de los lavados con SSF se decantarán en un vaso con
hipoclorito de sodio.
Los Guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminado con sangre
se depositarán en la bolsa roja de residuos biopeligrosos.

29

Torundas, servitoallas, guantes, envolturas y demás material no contaminado se
desechan en el contenedor de basura municipal


30

3.7 RESULTADOS

Datos del Paciente
Nombre______________________________________Edad______ Sexo____

3.7.1 Tablas

Tipificación Clásica y Antígeno D
Suero hemotipificador Anti-A Anti-B Anti-D

Aglutinación
Antígeno presente (A, B ó ninguno -O-)
(+) Aglutinó
(-) No aglutinó

Tipificación Inversa
Suspensión de eritrocitos Eritrocitos A Eritrocitos B
Aglutinación
Isoaglutinina presente (anti-A, anti-B)
(+) Aglutinó
(-) No aglutinó

Determinación del Factor Du. (Antígeno D negativo o dudoso)
Aglutinación
Muestra con albúmina
Muestra con suero de Coombs
(+) Aglutinó (-) No aglutinó

Grupo sanguíneo
Factor Rh

Pruebas Cruzadas
Proceso Centrifugación Incubación a 37°C Lavado con SSF y suero
1000 rpm/ 1 min y centrifugación de Coombs

Medio PM
salino Pm
Medio PM
proteico Pm
(+) Aglutinó PM. Prueba Mayor Pm. Prueba Menor
(-) No aglutinó

Grupo sanguíneo Donador
Grupo sanguíneo Receptor
% Compatibilidad
% Incompatibilidad

31

3.8 DISCUSIÓN

3.9 CONCLUSIONES

3.10 REFERENCIAS

32

PRÁCTICA No. 4

PRUEBAS DE COAGULACIÓN

Lourdes Galván R.

4.1 MARCO TEÓRICO
La hemostasia es el término que se aplica al conjunto de fenómenos que detienen o
combaten el sangrado de un vaso sanguíneo lesionado, el cual provoca una serie de
modificaciones físicas y bioquímicas de las sustancias participantes hasta llegar a la
transformación de la sangre líquida en un trombo o coágulo sólido, que sella con
eficacia los vasos rotos. Por lo que las hemorragias son consecuencia de anomalías
en la fase vascular, plaquetaria y/o en los factores de la coagulación.
El proceso de la coagulación se verifica en tres fases:
1) Aparición de actividad tromboplastínica. La tromboplastina es una sustancia celular
que se encuentra en plaquetas y tejidos transformando la:
2) Protrombina en trombina siendo necesaria la presencia de calcio. La protrombina
es una proteína que se sintetiza en el hígado y es dependiente de la vitamina K.
3) Transformación de fibrinógeno en fibrina, que mediante la participación de la
trombina logra gelificarse produciendo redes que recubre elementos celulares de la
sangre y finaliza con la formación de un coágulo.
En estas tres fases intervienen 16 factores de la coagulación que se activan en
“cascada” formando: la vía intrínseca, la vía extrínseca y la vía común.
Siendo de gran utilidad la realización de diversas pruebas en el laboratorio que ayuden
a la identificación correcta de la alteración en cualquiera de los tres sistemas antes
mencionados.
El citrato trisódico al 3,8 % es el anticoagulante recomendado para pruebas de
coagulación ya que conserva a los factores que participan en este proceso. La
dosificación en que se utiliza es 1 parte de anticoagulante para 9 partes de sangre.
El EDTA al 5% sólo se recomienda para realizar conteo plaquetario ya que actúa
inhibiendo el proceso de agregación, sin embargo no es útil para pruebas de
coagulación ya que inactiva algunos factores lábiles. La dosificación en la que se
utiliza es 0,02-0,04 ml de anticoagulante para 1 ml de sangre.
En la presente práctica se realizarán pruebas que apoyan a la evaluación de la
hemostasia: el tiempo de sangrado valora integralmente a la coagulación, el tiempo de
coagulación del plasma y el tiempo de tromboplastina parcial activada evalúan el
sistema intrínseco mientras que el tiempo de protrombina lo hace con el sistema
extrínseco. También se hará la evaluación cuantitativa de las plaquetas.

33

- Esquematiza la cascada de coagulación completa.
- Define petequia, hematoma y púrpura.
- Señala los cuidados que se deben tener al realizar pruebas de coagulación.

4.2 OBJETIVO
El alumno conocerá y seleccionará la muestra útil para realizar cada una de las
pruebas de coagulación indicadas para esta práctica y, mediante el conocimiento de
los fundamentos de cada método, aplicará la técnica adecuada para obtener
resultados confiables que reflejen el estado de salud o enfermedad del paciente
respecto a la hemostasia.

4.3 MATERIALES
4. 3.1 Muestras biológicas
 Sangre venosa anticoagulada con EDTA obtenida con jeringa
 Sangre venosa anticoagulada con citrato trisódico obtenida con jeringa
 Plasma rico en plaquetas (PRP) obtenido de la muestra citratada
 Plasma pobre en plaquetas (PPP) obtenido de la muestra citratada

1 Gradilla 1 Caja Petri c/algodón (cámara húmeda)
15 Tubos de ensaye (12x75) 1 Frasco con 10 ml de SSF (0,9%)
6 Tubos de ensaye (13x100) 1 Propipeta
2 Pipetas Pasteur 1 Tapón de hule para tubo 13x100
2 Pipetas de vidrio de 1 ml (1/10) 1 Contador
1 Pipeta salhi con manguera y boquilla 1 Cronómetro
1 Cámara de Neubauer 1 Microscopio
1 Marcador indeleble

Baños para incubación con gradilla Balanza
Termómetros Frascos con agua y una jeringa
Gradillas Torundas
Tubos de ensaye 15x150 Tubos capilares Lancetas
Pipeta graduada de 1 ml (1/100) Cuadros de parafilm para tubo 12x75
Pipetas graduadas de 1 ml (1/10) Cuadros de papel seda (5x5cm)
Pipetas graduadas de 5 ml Cuadros de papel filtro (2x5cm)
Pipetas graduadas de 10 ml Jeringas de 10ml c/aguja (21x32mm)
Propipetas Contenedor para punzocortantes
Centrífuga (16 tubos) Contenedor para desechos

34

4.3.4 Reactivos
Solución de EDTA al 5% Etanol al 70%
Citrato trisódico al 3,8 % Determinaciones de TTPA
Cloruro cálcico (0,025M) Determinaciones de TP
Oxalato de amonio al 1%

4.4 MÉTODOS
Recomendaciones
-Identificar perfectamente el material y los reactivos a utilizar.
-Rotular en forma clara cada uno de los tubos de ensaye y revisar la jeringa a
emplear.
-Dosificar en un tubo 13x100 la cantidad necesaria de citrato trisódico al 3,8 % para
6ml de sangre.
-Dosificar en un tubo 12x75 la cantidad necesaria de EDTA al 5% para 1ml de sangre.

4.4.1 Extracción de sangre y procedimiento de separación de muestras
-Colocar el torniquete poco apretado y mantenerlo el menor tiempo. Al momento de la
punción deberá causar el mínimo daño a los tejidos para evitar que la sangre se
contamine con tromboplastina tisular.
-Obtener 10 ml de sangre.
-Utilizar los primeros 3 ml para la prueba de Tiempo de coagulación (Ver
procedimiento)
-Vaciar 1ml en el tubo con EDTA tapar y mezclar por inversión. Utilizar esta muestra
para el conteo plaquetario.
-Vaciar los 6ml restantes en el tubo con citrato trisódico, taparlo y mezclar bien por
inversión. Centrifugar a 1.500 rpm/10 min y separar con una pipeta Pasteur 1ml del
plasma rico en plaquetas (PRP), vaciarlo en tubo 13x100. El PRP se utiliza para el
tiempo de coagulación del plasma.
- El resto de la muestra sanguínea se centrifuga a 3.000 rpm/15 min y separar en tubo
13x100 todo el plasma pobre en plaquetas (PPP). Esta muestra se utiliza para tiempo
de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada.

4.4.2 Conteo plaquetario
Fundamento. Se emplea sangre anticoagulada (con EDTA) la cual se diluye en
Oxalato de amonio al 1% que lisa el resto de las células sanguíneas para permitir el
recuento de plaquetas en el hemocitómetro.
Significado clínico: (Valor de referencia: 150.000-450.000 plaquetas/mm3)
a) Trombocitopenia, trombopenia o plaquetopenia:

35

*Disminución en la concentración de las plaquetas, por debajo de 130.000/mm3,
causas:
i) Disminución de la trombopoyesis: pancitopenia, anemia mielocítica
ii) Trombopoyesis ineficaz: Trombopenias hereditaria, Hemoglobinuria paroxistica
nocturna,
Déficit de ácido fólico o de vitamina B 12
iii) Aumento de la destrucción de las plaquetas: Púrpura trombcitopénica idiopática,
Púrpura trombótica trombocitopénica, Hiperesplenismo, Sepsis bacteriana,
Coagulación intravascular diseminada.
b) Trombocitosis:
*Aumento en la concentración de plaquetas, por encima de 450.000/mm3, causas:
i) Primarias: Trombocitemia esencial u otros síndromes mieloproliferativos.
ii) Secundarios: esplenectomía, infecciones que cursan con una formación de
depósitos purulentos, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, neoplasias malignas.
Procedimiento:
-En un tubo (12x75) que contiene 1,98 ml de oxalato de amonio al 1 % frío, agregar
0,02 ml de sangre con pipeta de Sahli.
-Tapar el tubo con papel parafilm y mezclar.
-Refrigerar 15 min.
-Llenar cámara de Neubauer y colocarla dentro de la cámara húmeda durante 5 min.
-Limpiar la base de la cámara.
-Observar al microscopio (10x), buscar la cuadrícula central.
-Cambiar el objetivo a (40x) con baja intensidad de luz contar las plaquetas
observadas.

NOTA: Las plaquetas se observan en forma ligeramente alargada o circular y presentan
refringencia.

CALCULO = # de plaquetas contadas x FACTOR = # de plaquetas/ mm3

4.4.3 Tiempo de coagulación
Fundamento. Es el tiempo que tarda en formarse el coágulo en una muestra de
sangre sin anticoagulante, al ponerse en contacto con una superficie de vidrio. Esta
prueba permite la detección de trastornos en la vía intrínseca o la vía común de la
coagulación.
Significado clínico. Valor de referencia 5 -10 min.
Se encuentran tiempos alargados en déficit de factores de la vía intrínseca por ejemplo
hemofilia, en casos de afibrinogenemia, en fibrinolisis excesiva y en terapias con

36

heparina. Debido a esto último la prueba se utiliza en el control de tratamientos
heparínicos.
Procedimiento
-Rotular previamente 3 tubos de ensaye 13x100: del 1 al 3
-Vaciar en cada tubo 1ml de la sangre extraída, comenzando por el tubo 1, momento
en el que se activa el cronómetro; cuidar que los tubos tengan el mismo volumen para
que la prueba sea válida.
-Incubarlos a 37° C en posición vertical.
-A los 4 min. sacar el tubo 1 y revisarlo inclinando suavemente, regresarlo a incubar,
seguir revisando cada 30seg y conforme transcurre el tiempo disminuirlo a 15seg
manteniéndolo el menor tiempo fuera de incubación hasta detectar la coagulación.
-Ahora se revisará el tubo 2 de la misma forma y una vez coagulado éste revisar el
tubo 3.
-Finalmente se reporta el tiempo del tubo 3 que es el menos manipulado.

4.4.4 Tiempo de coagulación de plasma (Test de Howell):
Fundamento. Mide el tiempo que tarda en coagularse un plasma rico en plaquetas
(PRP) cuando se vuelve a recalcificar.
Significado clínico. Valor de referencia: 90-130segundos.
La utilidad e interpretación de la prueba son similares a las del tiempo de coagulación,
su única ventaja, es que no se precisa realizarlo inmediatamente después de la
extracción de la muestra.
Procedimiento
-Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo:
-0,2 ml de PRP incubar a 37 ° C por 3 min.
-Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera:
-Adicionar 0,2 ml de CaCl 2 (0,025M) a 37° C,
-Mezclar, cronometrar e incubar, revisar aproximadamente a los 40 seg.
Continuar ***
*** -Fuera del baño inclinar el tubo suavemente y cerca de una fuente de luz.
*** -Observar la aparición de los primeros filamentos de fibrina en las paredes del
tubo, esto indica el punto final de la prueba.
*** -Detener el cronómetro y registrar el tiempo. Reportar el promedio de los 3
resultados.

37

4.4.5 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA).
Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP en presencia de un sustituto
del f3p que consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenidos a partir de cerebro
de conejo y se conoce como cefalina, pero además contiene una sustancia activadora
de los factores de contacto que puede ser: caolín, polvo de vidrio, celite o ácido
elágico. Esta prueba sirve para explorar la vía intrínseca y la vía común.
Significado clínico. Valores de referencia: 30-42 seg.
Tiempos prolongados se presentan ante déficit de factores de la vía intrínseca y para
el control de tratamientos con anticoagulantes, en concreto, de las terapias con
heparina.
Procedimiento
-0,1 ml de PPP e incubar a 37 ° C por 2 min.
-Agregar 0,1ml de reactivo de TTPa, mezclar e incubar 2 min. a 37° C.
- Agregar 0,1 ml de CaCl2 (0,025M) a 37° C, mezclar, cronometrar, incubar y leer
aprox. a los 25 seg. Continuar ***

4.4.6 Tiempo de protrombina (TP) o Tiempo de Quick.
Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en
contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística obtenida a partir de
extracto de cerebro o pulmón de conejo o humano. Esta prueba sirve para explorar a
la vía extrínseca y la vía común.
Significado clínico. Valores de referencia: 11-15 seg.
Tiempo de protrombina está alargado en pacientes con déficit de factores de la vía
extrínseca, en pacientes sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que
sufren algunos trastornos hepáticos.
Procedimiento
-0,1 ml de PPP e incubar a 37° C por 2 min.
-Agregar 0,2 ml de reactivo de TP mezclar, cronometrar, incubar y leer aprox. a los 8
seg. Continuar ***

4.4.7 Tiempo de sangrado con la técnica de Duke
Fundamento. Es el tiempo que transcurre desde la lesión a un grupo de capilares
hasta la formación del trombo blanco plaquetario. Se determina efectuando una

38

pequeña herida estandarizada (3 mm de profundidad) y midiendo el tiempo que tarda
en cesar el sangrado.
Significado clínico. Valor de referencia: 1 - 3 min.
El tiempo de sangrado está alargado en las púrpuras vasculares, en las
trombocitopenias, en las trombopatías congénitas, en la enfermedad de von
Willebrand y en los sujetos que han tomado acetilsalicílico.
Procedimiento.
- El lóbulo de la oreja debe estar caliente ya sea frotándolo o aplicando compresa de
agua caliente.
-Limpiar con una torunda con alcohol (70 %). Dejar secar.
-Hacer una incisión o herida de aprox. 3 mm de profundidad con una lanceta estéril.
-Al aparecer la primera gota de sangre cronometrar, dejarla que caiga sobre el papel
filtro o absorberla con éste, “sin tocar la piel” cada 15 ó 30 segundos.
-La muestra deja de tomarse cuando cesa la hemorragia.
-Detener el cronómetro. Registrar el tiempo.

Las agujas y lancetas se depositarán en contenedor para punzocortantes.
Las jeringas con tapón, guantes, torundas y papel filtro con sangre desechar en
contenedor para residuos biológicos.
Los tubos con muestras biológicas se desechan en contenedores con hipoclorito de
sodio al 6 %, que el laboratorista designará para tal fin.

39


40

4.7 RESULTADOS
4.7.1 Cálculos

Datos del Paciente
Nombre______________________________________Edad______ Sexo____

Determinación Resultado Valores de referencia Interpretación

Tiempo de sangrado

Tiempo de coagulación

TCP

TP

TTPa

Conteo plaquetario

41

4.8 DISCUSIÓN

4.9 CONCLUSIONES


42

PRÁCTICA No. 5.
QUÍMICA SANGUÍNEA I Y GLUCOSA POSPRANDIAL

Beatriz González M.

5.1 MARCO TEÓRICO
La química sanguínea está compuesta por una serie de pruebas de rutina que ayudan
a evaluar el estado general del paciente y permite saber si se requiere alguna
determinación más especializada.
Para realizar estas pruebas es necesario realizar un ayuno de 8 a 10 horas, con la
finalidad de que no afecta a la muestra la presencia de quilomicrones formados
después de la comida y que los analitos no se alteren por un ayuno prolongado.
Asimismo, las muestras ictéricas y hemolíticas pueden alterar la determinación.
En un principio comprendía las determinaciones de glucosa en ayuno, urea, creatinina
y ácido úrico. Actualmente, la química sanguínea se realiza en los laboratorios como
un perfil de hasta 30 analitos, que pueden incluir lípidos, proteínas, enzimas y
electrolitos.
La glucosa en ayuno es la prueba principal para el diagnóstico y seguimiento de la
diabetes mellitus, aunque debe realizarse en dos ocasiones con 2 semanas de
diferencia. De esta manera se ha propuesto la realización de la curva de tolerancia
oral a la glucosa, que además permite distinguir entre diabetes e intolerancia a la
glucosa; sin embargo, esta prueba requiere un mínimo de 4 tomas de muestra (en
ayuno y 1 cada media hora u hora). Existe la alternativa de la glucosa posprandial, que
requiere 2 tomas de muestra (en ayuno y dos horas después de la ingesta de
alimentos ricos en carbohidratos), teniendo el inconveniente de que el desayuno que
toma el paciente no está estandarizado por los laboratorios. Para esta prueba es
necesario que el paciente lleve tres días antes una dieta de entre 150 g y 250 g de
carbohidratos, por ejemplo, 2 rebanadas de pan tostado con mermelada en el
desayuno, comida y cena.
La urea es un producto de desecho formado a partir del metabolismo de las proteínas
y junto con la creatinina, producto de la degradación de la creatina a partir del
metabolismo muscular, permiten la evaluación del funcionamiento renal.
A su vez, el ácido úrico es un producto de desecho del metabolismo de las purinas
(adenina y guanina) que se utiliza en el diagnóstico del síndrome gotoso, que consiste
en la precipitación de cristales de ácido úrico en las articulaciones, provocando
inflamación y dolor.

43

- Explique la utilidad de la ley de Lambert-Beer en la realización de la práctica.
- Indique las longitudes de onda que conforman el rango UV-Visible en el espectro
electromagnético.
- Defina cada uno de los siguientes conceptos: Solución patrón, Solución blanco,
Solución control
- ¿Qué factores además del ayuno pueden afectar a las determinaciones?

5.2 OBJETIVOS
- El alumno conocerá la importancia del rango UV-Visible del espectro
electromagnético en las determinaciones de Química Clínica.
- El alumno conocerá el fundamento y la técnica de las determinaciones, a través de
la realización de las mismas, para que con base a sus resultados valore el estado
clínico del paciente.

5.3 MATERIALES
Suero obtenido en tubo al vacío de tapón rojo.
Plasma obtenido con tubo al vacío de tapón lavanda.
Nota: El desayuno que el paciente tomará inmediatamente después de la primera toma
de muestra es el siguiente: 250mL de jugo de naranja natural, un plato con cereal
azucarado en leche y un plátano, una rebanada de pan tostado con mermelada.

1 gradilla 1 adaptador para tubos al vacío
1 tapón para tubo de ensaye 13x100 1 propipeta
15 tubos 12x75 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100)
3 tubo de ensaye 13x100 5 puntas amarillas para micropipeta
2 pipetas pasteur con bulbo 1 cronómetro

Tubo al vacío de tapón rojo o dorado Recipiente para desecho RPBI
Tubo al vacío de tapón lila Pipetas graduadas de 5 ml
Aguja verde para tubo al vacío Pipetas graduadas de 1 ml
Algodón para torundas Pisetas con agua destilada
Aplicador de madera Centrífuga
Papel parafilm Balanza
Gasas Micropipeta de 5 a 40 ul
Espectrofotómetro UV-Visible Micropipeta de 5 a 50 ul
Celdas para espectrofotómetro Baño de agua
Vaso de precipitado de 250 ml Contenedor para punzocortantes
Agitador vórtex Termómetro

44

5.3.4 Reactivos
Alcohol para las torundas Kit para determinación de:
Agua destilada - glucosa
Hipoclorito de sodio - creatinina
- urea
- ácido úrico

5.4 MÉTODOS
5.4.1 Glucosa: método enzimático colorimétrico
Fundamento
GOD
D-glucosa + O2 + H2O2 Ácido glucónico + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD 4-(p-benzoquinona-iminofenazona) + 2H2O
quinonimina roja ( = 505 nm)
GOD: glucosa oxidasa; POD Peroxidasa

Significado clínico. El valor de referencia de la glucosa en ayuno es de 60 – 100
mg/dl. La determinación de glucosa apoya al diagnóstico y seguimiento de la diabetes
mellitus; puede existir hiperglucemia en alteraciones hipofisiarias (acromegalia,
Síndrome de Cushing), tiroideas, traumatismos. La hipoglucemia se presenta en
ayunos prolongados, por efecto del tratamiento erróneo de diabetes, posterior a la
ingesta prolongada de etanol, cuando hay insulinoma o enfermedades crónicas
hepáticas.
El valor de referencia de la glucosa posprandial es hasta 140 mg/dl. La realización de
glucosa posprandial apoya al diagnóstico de estados prediabéticos y de diabetes
mellitus.
Procedimiento
La técnica de las determinaciones que se realizarán en la presente y siguiente
prácticas son diferentes de acuerdo al fabricante de los reactivos utilizados.
Generalmente siguen el siguiente esquema:

Blanco Patrón Muestra
RT (ml)

Patrón (l)
Muestra (l)

que indica el uso de soluciones blanco, patrón y muestra, que son tratados bajo las
misma condiciones de incubación y lectura de longitud de onda. Para la descripción de

45

las técnicas es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos a
utilizar, verificando su vigencia.

5.4.2 Creatinina: método de Jaffé
Fundamento
Medio alcalino
Creatinina + ácido pícrico Picrato de creatinina
Significado clínico. El valor de referencia para mujeres es de 0,6 a 1,1 mg/dl y para
hombres es de 0,7 a 1,4 mg/dl. La creatinina es el mejor indicador de la función renal.
Aumenta en sangre cuando hay alteraciones glomerulares, necrosis o atrofia del
músculo esquelético, hipertiroidismo y durante el puerperio.

5.4.3 Urea
Fundamento: método colorimétrico
Ureasa
Urea + H2O CO2 + 2NH4+
NH4+ + salicilatos + hipoclorito indofenol (570 nm)

Fundamento: método de la ureasa-UV
Ureasa
Urea + H2O CO2 + 2NH4+
GLDH
NH4+ + -cetoglutarato + NADH (340 nm) + H+ NAD+ + glutamato
GLDH: glutamato deshidrogenasa
Significado clínico. El valor de referencia es de 10 a 45 mg/dl. La hiperuremia
(azoemia) puede clasificarse en:
-prerrenal: deshidratación; shock; disminución del volumen sanguíneo, fallo cardiaco,
catabolismo incrementado de las proteínas (fiebre, estrés y quemaduras)
-renal: enfermedad renal crónica, deshidratación, catabolismo incrementado de las
proteínas
-postrenal: obstrucción del tracto urinario
La hipouremia se manifiesta en alteraciones hepáticas, mala nutrición, ingesta alta de
líquidos y en el embarazo.

5.4.4 Ácido úrico
Fundamento
Uricasa
Ácido úrico + O2 + H2O Alantoína + H2O2 + CO2
POD
H2O2 + 4-aminoantipirina + DCBS quinonimina roja ( = 505 nm) + H2O

DCBS: dicloro bencensulfónico

46

Significado clínico. El valor de referencia es de 2,5 a 7,5 mg/dl. La hiperuricemia
primaria se observan cuando hay defectos enzimáticos hereditarios; la hiperuricemia
secundaria se presenta en insuficiencia renal; en gota, litiasis renal, insuficiencia renal,
síndrome de Lesh Nyhan y preeclamsia. La hipouricemia se manifiesta cuando hay
dieta baja en purinas, tratamiento excesivo con alopurinol, síndrome de Fanconi
(defectos de la resorción tubular), enfermedad hepática.

- Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes.
- Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basura
municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben
depositarse en la bolsa roja.
- Los guantes de látex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura
municipal.
- Los tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el
recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin.

47


48

5.7 RESULTADOS
5.7.1 Cálculos

Datos del Paciente
Nombre______________________________________Edad______ Sexo____

Determinación Resultado Valor de referencia Observaciones

Glucosa en ayuno

Glucosa posprandial

Creatinina

Urea

Ácido úrico

49

5.8 DISCUSIÓN

5.9 CONCLUSIONES

5.10 REFERENCIAS

50

PRÁCTICA No. 6.
QUÍMICA SANGUÍNEA II

René Damián S.

6.1 MARCO TEÓRICO
Como se explicó en la Química Sanguínea I, los perfiles de esta pueden abarcar hasta
30 determinaciones, de las que se realizaron Glucosa, Urea, Creatinina y Ácido Úrico.
En la presente práctica se determinarán analitos que están relacionados con el hígado,
que se encuentra en el cuadrante superior derecho del organismo, está dividido en dos
lóbulos desiguales unidos por el ligamento falciforme y tiene una irrigación de 1500 ml
de sangre por minuto. Se estima que lleva a cabo más de 500 actividades diferentes
entre las que se encuentran:
a) Metabolismo de carbohidratos, lípidos, aminoácidos y proteínas, bilirrubina,
hormonas, vitaminas
b) Almacenamiento de glucógeno, lípidos, aminoácidos y proteínas, hierro, cobre,
vitaminas
c) Síntesis de proteínas, tales como albúmina, proteínas de fase aguda, entre otras
d) Biotransformación de toxinas, alcohol, fármacos, bilirrubina, esteroides, otras
hormonas
e) Hematológica debido a la producción de factores de coagulación y de eritrocitos en
el feto
f) Excreción de ácidos biliares, colesterol y bilirrubina a través de la bilis,
g) Inmunológica: Fagocitosis (células de Kupffer), secreción de IgA, producción de
factores del complemento, además de formar parte del sistema fagocítico
mononuclear.
Debido a la diversidad de funciones de este órgano, no hay un analito único que
permita evaluar su funcionamiento general. Los analitos que se determinarán durante
la práctica pueden alterarse debido a patologías no relacionadas con el hígado, por lo
tanto el diagnóstico debe realizarse considerando todos los datos clínicos y de
laboratorio. De esta manera observamos que:
a) proteínas totales, albúmina, relación A/G, colesterol, triglicéridos y lípidos totales
evalúan la capacidad de síntesis y metabolismo hepático; los tres primeros además
apoyan a demostrar el estado nutricional del paciente o la posibilidad de que se
presente síndrome nefrótico, mientras que los últimos determinan el riesgo aterogénico
e hipertensión;

51

b) bilirrubinas directa, indirecta y total son pruebas que valoran la biotransformación y
excreción hepática, conjuntamente indican el origen de la ictericia.

- Investigue el metabolismo completo (formación a eliminación) de las bilirrubinas.
-¿Cuál es la estabilidad y condiciones de almacenamiento de cada uno de los analitos
que se evaluarán?
-¿Cuál es el tiempo máximo de ayuno para realizar las determinaciones? ¿Por qué?

6.2 OBJETIVOS
- El alumno conocerá el fundamento y la técnica de las determinaciones, a través de
la realización de las mismas, para que obtenga resultados confiables.
- El alumno conocerá la importancia clínica de las determinaciones y con base a sus
resultados valore el estado clínico del paciente.

6.3 MATERIALES
Suero obtenido en tubo de tapón rojo o dorado

1 gradilla 1 propipeta
5 tapones para tubo de ensaye 13x100 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100)
18 tubos 12x75 5 puntas amarillas para micropipeta
5 tubos de ensaye 13x100 5 puntas azules para micropipeta
1 pipetas pasteur con bulbo 1 cronómetro
1 adaptador para tubos al vacío

Tubo al vacío de tapón rojo o dorado Micropipeta de 5 a 40 ul
Aguja verde para tubo al vacío Micropipeta de 5 a 50 ul
Algodón para torundas Baño de agua
Aplicador de madera Termómetro
Gasas Papel parafilm
Espectrofotómetro UV-Visible Centrífuga
Vaso de precipitado de 250 ml Recipiente para desechos (RPBI)
Agitador vórtex Contenedor para punzocortantes
Mechero Bunsen Pisetas con agua destilada
Tripie Pipetas graduadas de 1 ml
Tela de asbesto Pipetas graduadas de 2 ml
Pinzas para tubo de ensaye Pipetas graduadas de 5 ml

52

6.3.4 Reactivos
Kit para determinación de Alcohol para las torundas
- proteínas totales Agua destilada
- albúmina Hipoclorito de sodio
- colesterol
- triglicéridos
- lípidos totales
- bilirrubinas

6.4 MÉTODOS
NOTA: Para conocer el procedimiento para todas las técnicas utilizadas en esta
práctica es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos
disponibles en el laboratorio.
6.4.1 Proteínas totales: método del Biuret
Fundamento
Proteínas + Cu2+ Medio alcalino Complejo azul violeta ( = 560 nm)
Significado clínico. El valor de referencia es 6,1 – 7,9 g/dl. La hiperproteinemia
puede presentarse durante la deshidratación o diarrea grave. La hipoproteinemia se
observa en inanición o mala absorción (desnutrición), hepatopatías, síndrome
nefrótico, hemorragias.

6.4.2 Albúmina: método de verde bromocresol
Fundamento Medio alcalino

Albúmina + Verde de bromocresol (VBC) Complejo albúmina-VBC
( = 600 nm)
Significado clínico. El valor de referencia es 3,5 – 4,8 g/dl. La albúmina es el
principal indicador nutricio-proteico. La hiperalbuminemia se manifiesta durante la
deshidratación. La hipoalbuminemia se presenta en alteraciones hepáticas, donde
puede apoyar a determinar la gravedad y pronóstico de enfermos crónicos; también se
observa en alteraciones renales y gastrointestinales.
Con estas determinaciones es posible determinar la cantidad de globulinas,
considerando que la suma de estas con la albúmina es igual a las proteínas totales. La
relación A/G se define como el cociente de la albúmina entre las globulinas (proteínas
totales menos la albúmina).

6.4.3 Colesterol: método enzimático colorimétrico
Fundamento
CEH
Ésteres de colesterol + H2O Colesterol + ácido graso
COx
Colesterol + O2 Colest-4-en-3-ona + H2O2

53

POD
H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol quinonimina roja ( = 505 nm) + 2H2O
CEH: Colesterol éster hidrolasa; COx: Colesterol oxidasa; POD: Peroxidasa
Significado clínico. El valor de referencia es 60 – 200 mg/dl. La determinación de
colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. La hipercolesterolemia
se ha relacionado con la formación de placas ateroscleróticas, con pacientes
hipertensos y obesos, en los cuales se incrementa el riesgo de enfermedad cardiaca
coronaria. La hipocolesterolemia puede relacionarse con alteraciones en la síntesis de
hormonas esteroideas.

6.4.4 Triglicéridos: método enzimático colorimétrico
Fundamento
Lipoprotein lipasa
Triglicéridos glicerol + ácidos grasos
GK
Glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP
GPO
Glicerol-1-P + O2 H2O2 + Dihidroxiacetona fosfato
POD
2 H2O2 + 4-aminofenazona + clorofenol quinonimina roja ( = 505 nm)

GK: Glicerolcinasa; GPO: glicerol fosfato oxidasa; POD: Peroxidasa
Significado clínico. El valor de referencia es 50 – 150 mg/dl. La hipertrigliceridemia
es un factor riesgo en enfermedades ateroscleróticas. Su medición es importante en el
diagnóstico y manejo de hiperlipidemias, que pueden ser de origen genético o estar
relacionadas con nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endocrinas.

6.4.5 Lípidos totales: método de ácido fosfórico vainillina
Fundamento
Lípidos + H2SO4 Cetonas


Cetonas + ácido fosfórico-vainillina complejo rosa ( = 505 nm)

Significado clínico. El valor de referencia es 450 – 850 mg/dl. El interés en su estudio
se debe a su conexión entre hiperlipemia y aterosclerosis, diabetes y enfermedad
cardiaca.

6.4.6 Bilirrubinas: método de Van den Bergh
Fundamento
Bilirrubina directa + ácido sulfanílico diazotado azobilirrubina
Bilirrubina total + desarrollador + ácido sulfanílico diazotado azobilirrubina
( = 530 nm)

54

Significado clínico. Los valores de referencia son:
Bilirrubina directa hasta 0,2 mg/dl, Bilirrubina indirecta hasta 0,8 mg/dl, Bilirrubina total
hasta 1,0 mg/dl. La determinación de bilirrubinas apoya a la evaluación y clasificación
de la ictericia (hiperbilirrubinemia):
Ictericia Defecto fisiológico Ejemplos de etiología
Prehepática Producción excesiva de bilirrubina Ictericia hemolítica
no conjugada
Hepática no Transporte defectuoso de la bilirrubina Síndrome de Gilbert
conjugada Deficiencia de la glururoniltransferasa Síndrome de Crigler-Najjar

Hepática Hepatocelular: lesión del parénquima Hepatitis vírica o tóxica;
conjugada: cirrosis
Hepatocanalicular: parecida a la Cirrosis biliar primaria;
obstructiva hepatitis
Posthepática Obstrucción mecánica del árbol biliar Carcinoma del páncreas o
conjugada: del colédoco; coledocolitiasis

- Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes.
- Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basura
municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben
depositarse en la bolsa roja.
- Los guantes de látex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura
municipal.
- Los tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el
recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin.

55


56

6.7 RESULTADOS
6.7.1 Cálculos

6.7.2 Tabla de resultados
Datos del Paciente
Nombre______________________________________Edad______ Sexo____

Determinación Resultado Valor de referencia Observaciones
Proteínas totales
Albúmina
Relación A/G
Colesterol
Triglicéridos
Lípidos totales
Bilirrubina directa
Bilirrubina indirecta
Bilirrubina total

57

6.8 DISCUSIÓN

6.9 CONCLUSIONES


58

PRACTICA No. 7
URIANÁLISIS

Leticia Arellano M.

7.1 MARCO TEÓRICO

La orina es un filtrado del plasma sanguíneo que prácticamente no contiene proteínas.
La formación de orina comprende los complejos procesos de filtración de la sangre,
reabsorción de sustancias esenciales incluyendo el agua y secreción tubular de ciertas
sustancias. Después de la formación en el riñón, la orina pasa por el uréter hacia la
vejiga en donde es almacenada temporalmente antes de ser excretada a través de la
uretra. En promedio un adulto joven elimina entre 800 a 1.500 mL en 24 horas.

Algunos padecimientos renales o extra-renales modifican las características físicas y
químicas de la orina, lo que constituye un indicador importante del estado de salud. El
análisis de rutina de la orina conocido también como urianálisis o examen general de
orina, incluye una serie de pruebas de detección que permiten descubrir algunos de
los padecimientos arriba mencionados.

La calidad del urianálisis comienza con una adecuada recolección de la muestra de
orina, la cual debe realizarse (previa asepsia de genitales) en un recipiente limpio y
seco de preferencia desechable. Para realizar el urianálisis se pueden utilizar
muestras emitidas a cualquier hora del día, sin embargo la muestra más recomendada
es la primera orina de la mañana, porque es más concentrada y es más probable que
revele anormalidades.

Como la orina contiene sustancias orgánicas e inorgánicas que favorecen la
reproducción bacteriana, se recomienda realizar el urianálisis en orina fresca, de ser
posible dentro de los 30 minutos después de colectada.

- ¿Qué indicaciones se le deben de dar a un al paciente que se le realizará un
urianálisis?
- ¿Cuál es la composición de la orina?
- ¿Qué son y en donde se forman los cilindros?

59

- ¿Qué significa: anuria, poliuria, oliguria, hematuria y cetonuria?

7.2. OBJETIVO
El alumno interpretará los resultados emitidos de un urianálisis, relacionando la
importancia de la adecuada recolección de la muestra de orina, el conocimiento del
fundamento de las determinaciones realizadas y la identificación al microscopio de las
estructuras presentes en la orina centrifugada, a fin de descartar alguna enfermedad.

7.3 MATERIALES
50 mL de orina recién emitida

7.3.2 Material por equipo de trabajo
3 Tubos de ensaye 13x100 mm 1 Bomba de succión para pipeta Pasteur
1 Gradilla para tubos de ensaye 1 Microscopio óptico compuesto
1 Pipeta Pasteur

Centrífuga con capacidad para tubos de ensaye Portaobjetos
13x100 mm y 2000-3000 rpm. Cubreobjetos
Balanza granataria Papel seda para limpiar lentes
Piseta con agua destilada del microscopio

7.3.4 Reactivos
Tira reactiva para análisis de orina.

7.4 METODOS
- Homogenizar y permitir que la muestra de orina a este a temperatura ambiente
antes de realizar el estudio.
- Rotular dos tubos 13x100 mm (tubo 1 y tubo 2). Trasvasar aproximadamente 6 mL
de orina a cada tubo.

7.4.1. Análisis físico de la orina
Fundamento
La determinación se basa en la observación macroscópica de la muestra de orina a fin
de detectar alguna alteración en su aspecto o color.
Significado Clínico
En la mayoría de los casos es escasa la información que aporta está determinación,
debido a que la orina normal habitualmente es clara y presenta una amplia gama de
colores, debida a la presencia de pigmentos urocrómicos (urobilina y uroeritrina). Sin
embargo existen muchos factores patológicos y no patológicos que pueden alterar el
color y aspecto normal de la orina.

60

La orina es muy pálida o incolora entre otras cosas debido a un elevado consumo de
líquidos o a estados patológicos como la diabetes mellitus.
La causa más común del color rojo de la orina es la presencia de eritrocitos
(hematuria), aunque también puede deberse a la presencia de hemoglobina libre o
mioglobina.
La orina de color castaño a negro puede deberse a la excreción de ácido
homogenístico, característico de la alcaptonuria.
Los pacientes que tienen ictericia obstructiva excretan pigmentos biliares como la
bilirrubina, y la orina es de color castaño-amarillento a verde-amarillento.
En cuanto a la turbidez de la orina, puede ser debida a la presencia de cristales,
leucocitos, células epiteliales, bacterias, moco o grasa.
Procedimiento
- Se puede emplear cualquiera de los dos tubos. Observar el aspecto (presencia o
no de turbidez) y color de la orina. Anotar resultados.

7.4.2 Análisis químico de la orina
El análisis químico de la orina empleando tiras reactivas es un método sensible y
rápido que ayuda a identificar alteraciones en la composición de la orina. La tira
reactiva es una banda de plástico con pequeños cuadros de papel impregnados con
los reactivos necesarios para identificar diferentes analitos en una misma tira.
Fundamento
- pH. Utiliza dos indicadores, rojo de metilo y azul de bromotimol que cubren la
escala de pH que va del 5 al 9.
- Glucosa. Se basa en la determinación enzimática con glucosa oxidasa, que sigue
las mismas reacciones que el método enzimático colorimétrico para glucosa,
empleado en la química sanguínea 1.
- Proteínas. Se basa en el cambio de color (de amarillo a azul), del indicador azul de
tetrabromofenol en presencia de proteínas.
- Sangre oculta. Se basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina que
cataliza la oxidación del indicador tetrametilbencidina por la acción de peróxido de
hidrógeno.
- Cetona. La tira reactiva contiene nitroprusiato de sodio que en medio alcalino
forma un complejo color castaño con el ácido diacético.
- Nitritos. El nitrito en presencia de una sulfanilamida genera un sal de diazonio que
al reaccionar con una tetrahidrobenzoquinolina produce un colorante azoico de
color rojo.

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