Biología Molecular

2. TITULO PRINCIPAL
Santiago Ramírez Calderón
Jorge Andrés Ramírez Orozco

5. Neuroblastom

12. Materiales y métodos
celúlas y reactivos:
Las líneas celulares cultivadas fueron:
• De neuroblastoma humano SK-N-BE (2) c y
KCN-69n.
• Línea celular de cáncer de mama MCF7
(ATCC)
• Del cáncer de próstata DU 145 (ATCC)
• Cáncer adenocarcinoma de células renales
de 786-0 (ATCC)
• Cáncer no microcítico de las células del
pulmón A549 (ATCC).

13. Materiales y métodos
celúlas y reactivos:
• Para abordar si el aumento en los niveles de ARNm HIF2A en hipoxia se
debía a la estabilidad del ARNm alterado o la transcripción de novo, se
trataron células de neuroblastoma con actinomicina D(inhibidor de la
síntesis de ARN) a normoxia o hipoxia.
• A fin de validar los posibles efectos de ERRa sobre la transcripción
HIF2A, se trataron las células de neuroblastoma con la ERRa agonista
inverso XCT790.

14. Materiales y métodos
celúlas y reactivos:
Con el fin de determinar los efectos sobre
la expresión de ARNm de HIF únicamente
por la estabilización de los HIF y no
mediante la activación de la maquinaria
hipóxico completa se trataron dos líneas celulares de
neuroblastoma con DIP , un quelante de
hierro, en normoxia.
Esto conduce a la inhibición de la hidroxilación
dependiente de hierro y posterior
degradación de las subunidades HIF alfa y en
su lugar, HIF-1a y HIF-2a se estabilizan

15. TODO ESTO SE HIZO PARA PROPICIAR UN AMBIENTE IDÓNEO PARA EL
CRECIMIENTO DE LAS LÍNEAS CELULARES,MEDIANTE EL USO DE MEDIOS
DE CULTIVO INCLUYENDO EL RPMI-16-40 ENTRE OTROS FACTORES
COMO LA INSULINA,AMINOÁCIDOS ESENCIALES E.T.C;Y SIMULAR EL
MEDIO EN EL CUAL QUERÍAN ANALIZAR LA EVOLUCIÓN DE LAS
DIFERENTES LÍNEAS CÉLULARES COMO LA HIPOXIA.
Materiales y métodos
celúlas y reactivos

16. Materiales y métodos
transfección
Para los estudios de knockdown de HIF, las
células fueron transfectadas con siARN(ARN
pequeño de interferencia) dúplex focalizando en
HIF-1a o HIF-2a respectivamente, y como control,
se utilizó la secuencia de HIF-1a invertida.
Para los estudios de knockdown de ESRRA, siRNA
contra ESRRA.
Consiste en la introducción de material
genético externo en células
eucariotas mediante plásmidos, vectores
víricos u otras herramientas para la
transferencia.

17. Materiales y métodos
Western blotting
• Es otra variación de la transferencia southern. Las
proteínas procedentes de extractos celulares son
separados por electroforesis en gel según su
tamaño, por medio de la técnica SDS-PAGE
poliacrilámida gel electroforesis,en la que son
disueltas en una solución con el detergente sodio
duodecil sulfato(SDS),cargado negativamente.
Tras la electroforesis las proteínas se
transfieren a un filtro,que se incuba con
anticuerpos que reaccionan con la proteína de
interés.El anticuerpo unido al filtro puede ser
detectado de varias maneras,identificando de
este modo la proteína contra la cual está
dirigido el anticuerpo.

18. Materiales y métodos
Western blotting• SK-N-BE(2)c y KCN-69n cells fueron tratadas con DIP al 21% O2 y la expresión de
proteínas fue determinada por western blot.

19. Materiales y métodos
Western blotting

20. Materiales y métodos
PCR-Q
Para ello emplea, un molde de
ADN, al menos un par de
cebadores específicos,4
dNTPs,MgCl2,h20 un tampón de
reacción adecuado, y una ADN
polimerasa termoestable
El fluorocromo emite una intensidad de
fluorescencia proporcional a la cantidad de
ácidos nucleicos a los cuales se han unido.
La PCR q=PCR convencional
+Fluorocromo,y se cuantifica.
La PCR consiste
en aumentar un
segmento
específico de
ADN,usando
polimerasa,obteni
endose miles o
millones de
copias.
Está basada en 3
reacciones de
ciclos repetitivos:
1.Denaturación
2.Hibridación
3.Polimerización
Después éste es cuantificado

21. Materiales y métodos
PCR-Q
• Los niveles de expresión de genes de referencia (YWHAZ, SDHA y UBC para SKN- BE (2) c,
KCN-69N, 786-0 y células MCF7; GAPDH para DU 145 células, y UBC, PDD y HPRT1 para las
células A549)
• Identificaron miembros del PGC/ERR como un regulador potencial de HIF2A.

22. Materiales y métodos
knockdown
• Hace referencia a una técnica de genética molecular mediante la cual
un organismo es genéticamente modificado para tener una expresión
reducida de uno o más genes de su cromosoma a través de la inserción
de pequeños fragmentos u oligonucleótido cortos de ADN o ARN con
una secuencia complementaria de un gen activo o de su transcrito
de ARNm.

23. Materiales y métodos
knockdown
Mirar que tanto se expresan hf1a y hf2a haciendo el knockdown de algunos
genes.

24. Resultados

25. Resultados

26. Resultados

27. Resultados

28. Resultados

29. Discussion

31. Conclusions
• This work will be really helpful for the medicine community,
because they can use it as a tool to do more experiments about
this HIFs and the most important part it association with the
neuroblastoma.
•Also we think that the inhibition of the expression of ERRa
could be a specific target for tumors growth in patients and in this
line one possible new therapeutic technique for the neuroblastoma.