caracterizacion fisica y fenotipica de DNA recombinante

2. Ingeniería genética
Conjunto de técnicas empleadas para aislar, manipular y transferir DNA
foráneo a una célula y lograr que se replique y/o exprese en ella.
Las técnicas que emplea la
ingeniería genética se
denominan técnicas de
DNA recombinante.

3. Clonación
Proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un vector y
obtener múltiples copias de ella en un organismo por acción de la DNA
polimerasa.

5. Se lisan células, después se precipita el DNA. Se agregan las enzimas de
restricción y se aísla el fragmento deseado de clonación del DNA por
medio de electroforesis, centrifugación o cromatografía líquida de alta
presión.
1. Obtención del DNA que se desea clonar
- Enzimas de restricción
- PCR
- RTPCR
- Síntesis química

6. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción son de gran especificidad de reconocimiento de una
secuencia corta de DNA. Son las principales herramientas del DNA recombinante.

8. Género Especie
Orden de
descubrimiento
Cepa
Nomenclatura de enzimas de restricción

10. SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO DE ALGUNAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Organismo Nombre de la enzima
Secuencia de
reconocimiento
Bacillus globigii BgIII A↓ GATCT
Bacillus subtilis BsuRI GG↓ CCR
Brevibacterium albidum BalI TGG↓ CCA
Escherichia coli EcoRI G↓ AATTC
Haemophilus haemolyticus Hhal GCG↓ C
Haemophilus influenzae HindII GTPy↓ PuA
Haemophilus influenzae HindIII A↓ AGCTT
Klebsiella pneumoniae Kpnl GGTAC↓ C
Nocardia otitidiscaviarum Notl GC↓ GGCCGC
Proteus vulgaris Pvul CGAT↓ CG
Serratia marcescens Smal CCC↓ GGG
Thermus aquaticus Taql T↓ CGA

11. PCR
- Reacción enzimática que
amplifica millones de veces
una secuencia específica de
DNA durante varios ciclos en
los que dicha secuencia blanco
es copiada, esta reacción
aprovecha la actividad de la
DNA polimerasa.
RT-PCR
- En está se utiliza DNa
complementario (cDNA)
proveniente del mRNA.
- Esta reacción es controlada
por la enzima transcriptasa
reversa capaz de convertir
mRNA en cDNA.

13. RT-PCR

14. - Fosfato-Diéster,
- Fosfato-Triéster,
- Fosfito-Triéster
- H-fosfonato.

16. Molécula de DNA de
tamaño pequeño, fácil
de aislar y caracterizar,
con secuencia y mapa
de restricción conocidos,
fácil de introducir a la
célula hospedera y
capacidad de replicación
autónoma.
2. Elección del VECTOR

17. Vector Base
Límites de tamaño de
inserción
Plásmidos Multicopias ≤ 10 kb
Fago Bacteriófago λ 5 – 20 kb
Cosmido
Plásmido contiene un
bacteriófago λ sitio cos
35 – 45 kb
BAC Plásmido F 75 – 300 kb
YAC
Centromero, telomero y
secuencia autónoma de
replicación
100 – 1000 kb
MAC
Centromero, telomero y origen
de replicación de mamífero.
100 kb > 1 Mb
Principales características de los diferentes sistemas de clonación de vectores.

18. PLÁSMIDO COMO VECTOR DE CLONACIÓN
• Tamaño pequeño
(DNA aislado y
manipulado
fácilmente)
• Origen de replicación
• Sitio multiclonación
• Marcadores
seleccionables
Ejemplo de vector de
clonación:
Plásmido
pUC19

19. Plásmido pBR 322
Se obsemarcadores rvan los
de resistencia a
antibióticos al igual que
los sitios de restricción.

20. Uso de
bacteriofago
lambda como
vector de
clonación.

21. Uso de YAC como vectores
de clonaciónBAC como vector de clonación

22. Vector sintético que
combina
características de un
plásmido con las de
un fago.
Cósmidos

23. 3. Obtención del DNA recombinante
Etapa del proceso
que consiste en la
unión covalente, in
vitro, del DNA de
interés al vector
mediante una
ligasa.

24. Asociaciones entre fragmentos de restricción con extremos
compatibles.

25. Con enzimas de restricción se evita la formación de
productos secundarios.
Mediante desfosforilación del vector.

26. Estos métodos pueden ser
físicos y químicos:
 Transformación (Formación
de Células competentes)
 Electroporación
 Transducción
 Lipofección
 Microinyección
 Biobalística

28. Electroporación

29. Microinyección Biobalística

30. Métodos de selección de Clonas
Recombinantes
Fenotípicos: Alfa complementación
Inactivación insercional
Físicos: Electroforesis
Southern blot
Northen blot
Inmunológicos: Western blot
RIA

37. Usado para separar moléculas de DNA (y RNA) de acuerdo a
su tamaño.

39. Radio Inmuno Análisis
Técnica competitiva en la que la molécula antigénica que se quiere
determinar compite por unirse a un anticuerpo especifico con un
trazador radiactivo.

40. Artículo
Expresión en Escherichia coli de un
Gen sintetizado químicamente para la
hormona somatostatina.

41. Somatostatina.
 Tamaño pequeño
 Secuencia de aminoácidos conocida
 Sensibilidad a radioinmunoensayos y
ensayos biológicos.
 Interés biológico (La Somatostatina inhibe la
secreción de hormona del crecimiento,
insulina y glucagón, potencial valor
terapéutico en la acromegalia, pancreatitis
aguda, y diabetes insulino dependiente)

42. Objetivo.
Obtener somatostatina activa
mediante la expresión de un
gen sintetizado químicamente.

43. Restricciones
Se usaron los
codones que
favorecen en E. coli
la expresión del
genoma de MS2
Se evitaron las
secuencias ricas en
G.C seguidas de T.A
Se diseñaron
fragmentos capaces de
eliminar los
apareamientos no
deseados.
Selección arbitraria de los codones
Código genético degenerado
Muchas secuencias codificantes para los mismos 14 aminoácidos
Selección
de los
codones

44. Figura 01. Esquema del plan experimental del gen de
somatostatina, obtenido por síntesis química de DNA. Fusión
de la β- galactosidasa de E. coli en el plásmido pBR322.

45. ¿Cómo se sintetizó el gen codificante para
somatostatina?
Utilizando el método de Khorana (o método de Triéster) se sintetizaron 8
oligodesoxirribonucleótidos.
 Los codones de aminoácidos eran conocidos por ser favorecidos en E. coli para la expresión
del genoma MS2 cuando era apropiado.
 Evitar interacciones inter e intramoleculares.
 Evitar las secuencias ricas en GC y AT para evitar que terminasen la transcripción.
 Los extremos 5’ son extremos cohesivos de cadenas sencillas para EcoRI y BamHI
 Un codón para metionina precede al codón para el extremo amino de la somatostatina. Y
dos codones sin sentido están posteriores al codón que codifica para el extremo carboxilo.

46. Figura 02. Síntesis química del gen para somatostatina.

47. + T4 DNA polimerasa
Eco RI
DNA lplac5
Hae III
pBR322 pBH10
47
Construcción del plásmido
recombinantes

48. + Digestión parcial con EcoRI
RNA polimerasa
+ S1 exonucleasa
+ Unión con T4 DNA ligasa
pBH10 pBH20
48

49. pBH20 pSom I
49
T4 Ligasa
+ Purificación del fragmento
más largo
+ Digestión con fosfatasa
alcalina
Digestión con EcoRI y
BamI
Inserción del DNA sintetizado,
codificante para somatostatina

50. +Purificación del
fragmento más largo
Digestión con
EcoRI y con Pst I
Insertar
nuevamente
secuencias
Apr y
controlador
Lac
pSom I pSom II
50
Purificación del
fragmento PstI-
EcoRI del plásmido
pBR322
T4 ligasa
• No se presenta actividad
radioinmune de somatostatina.
• La somatostatina generada es
degradada por su pequeño tamaño

51. Digestión parcial con EcoRI
Digestión con EcoRI
Digestión con EcoRI del lplac
para obtener secuencia control
del operon de Lactosa más gen
estructural de β-galactosidasa
pSomII
51
pSomII-3

52. Plásmidos
obtenidos a
partir de
pSOM11
pSOM11-2
pSOM11-4
Tienen la
orientación
opuesta del
operón de lac.
El péptido
sintetizado es
muy similar a la
somatostatina.
No presentan
actividad
radioinmune
pSOM11-3
pSOM11-5
pSOM 11-6
pSOM11-7
Tienen la
orientación
deseada del
operón de lac.
Presenta
actividad
radioinmune
pSOM11-3 se analiza
para los
radioinmunoensayos

53. Figura 04. Secuencias de nucleótidos de los plásmidos lac-somatostatina.

54. Las cepas E. coli pSOM11-5 y E.
coli pSOM11-4 se sembraron y se
adicionó IPTG. Se resuspendieron
en 500 µL de ácido fórmico al 70%
con bromuro de cianógeno.
La actividad de la somatostatina
está bajo control del operón lac
como se evidencia por la inducción
por IPTG (isopropilgalactósido), un
inductor del operón lac.

55. Extractos de 11 clones
tratados con bromuro de
cianógeno, una muestra de
cada uno se tomó para
radioinmunoensayo.
•Barras altas: plásmido con
orientación correcta
(producen somatostatina)
•Barras bajas: plásmidos con
orientación incorrecta.

56. Extractos positivos (pSomII-3,
II-5, II-6 y II-7) y negativos
(pSomII -2, II-4, y II-11) fueron
tratados con ácido fórmico y
bromuro de cianógeno
Las muestras se aplicaron a
una columna de Sephadex G-
50 en ácido acético 50%.
•Somatostatina sintetizada por
las clonas positivas eluye igual
que la somatostatina testigo.

57. Figura 05. Ligación y
análisis en gel de
acrilamida de DNA de
la somatostatina.
 1 Y 2. Unión de fragmentos A,B,C,D y E,F,G,H (respectivamente).
 3. Las dos medias moléculas (Fragmentos A + B + E + F y C + D + G +
H) se unieron mediante una etapa de ligación adicional.
 4. Tratamiento con calor.
 5. Adición de BamII para escindir las formas multiméricas del ADN de
somatostatina.
 6. Adición de Nacl 100 mM y digestión con EcoRI.
 7. Gen de somatostatina completo.
Análisis de ligadura y
gel de acrilamida del
DNA de la
somatostatina.

59. Conclusiones
 Existe actividad radioinmune en la somatostatina proveniente del plásmido recombinante
pSOM11-3, el cuál contiene al gen de somatostatina de secuencia correcta demostrada
y tiene la orientación correcta del fragmento de ADN lac Eco RI.
 No se detecta actividad radioinmune hasta que se realiza un tratamiento con bromuro de
cianógeno.
 La actividad de la somatostatina está bajo el control del operón lac
 La actividad de la somatostatina generada es igual a la de la somatostatina de
referencia en cromatografía con Sephadex G-50.
 La somatostatina obtenida a partir de E. coli RR1 (pSOM11-3) inhibe la liberación de
hormona de crecimiento en ratas.
 Es la primera expresión de un gen sintetizado.

60. Práctica
Caracterización fenotípica y física de DNA
recombinante.

61. Objetivos
- Obtener DNA de doble cadena de los plásmidos recombinante y no
recombinante derivados del pCR2.1-TOPO.
- Obtener Células competentes de E. coli y transformarlas
- Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por
pruebas fenotípicas y de restricción

62. ★ Caldo Luria (L)
★ Agar Luria (L)
★ Agar Luria con ampicilina (L-ap)
Triptona 10.0 g
Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 10.0 g
Agua 1.0 L
Medios de cultivo.

63. -Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO.
-Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO-ape.(plásmido
recombinante con un inserto de 1.2 kpb que contiene el gene que codifica la
aminopeptidasa del hongo Ustilago maydis).
-Escherichia coli DH10B
Cepas

64. Vector pCR2.1-TOPO

65. Desarrollo experimental
A. Obtención del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO recombinante y no recombinante utilizando la
técnica de lisis alcalina.
1er. día.

66. Desarrollo experimental
A. Obtención del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO recombinante y no recombinante utilizando la
técnica de lisis alcalina.
2do. día

67. Solución I BD
Tris-HCL (pH 8.0) 1M
EDTA 0.25M
Glucosa 1M
Agua destilada
Conservar en refrigeración
Función:
• Tris: Regula el pH
• Inactiva otras DNAsas al tomar los iones
Mg+
Solución II BD
NaOH 1N
Dodecil sulfato de sodio
Agua destilada
Guardar a temperatura ambiente sin producir
floculación
Función:
• pH alcalino desprotona las bases nitrogenadas y
permite la desnaturalización de la doble cadena de
DNA.
• SDS aumenta la permeabilidad de la membrana

68. Desarrollo experimental

70. Solución III BD
Acetato de Potasio 5M
Ácido acético glacial
Agua destilada
Guardar son en refrigeración
Función:
• El ácido acético glacial neutraliza el medio en
que se encuentra el DNA
• El acetato de potasio en elevada
concentración permite la precipitación del
DNA
Solución
Fenol:cloroformo:alcohol
isoamilico 25:24:1
Preparar al momento de usar
Función:
• Precipitación de algunas proteínas debido a que
la reacción se realiza en presencia de SDS y alta
fuerza iónica.
• Cloroformo permite la extracción de proteínas.
• Alcohol isoamílico modifica la constante
dieléctrica.

71. Mantener en frío
5 minutos
12000xg por 2 min
A 4°Cc
Descartar
sobrenadante y lavar
pastilla con 1ml de
etanol frío
12000xg por 2 min
A 4°Cc
Permitir la
evaporación del
etanol
Disolver DNA con 30
µl de TE pH 8.0
Solución TE pH 8.0
Tris-HCl 1 M
EDTA 0.01 M
Agua bidestilada
Función:
• Tris: Regula el pH
• Inactiva otras DNAsas al tomar
los iones Mg+

72. B. OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES DE LA CEPA
Escherichia coli DHB10
Inocular con la cepa
de E. coli DHB10 en
3 ml de medio L con
sm
Incubar a 37 °C
con agitación
toda la noche
500 µl a matraz
con 100 ml de
medio L
Incubar a 37 °C
con agitación de
2 a 4 hrs.
Transferir a
baño de hielo
por 10 min.
Transferir a tubo
de centrífuga
frío
Centrifugar por
10 min en frío
Eliminar
sobrenadante

73. 25 ml de Sol. De
Transformación fría
Mezclar por
inversión suave
Incubar por 30 min 5000xg por 10 min
A 4°C
Eliminar sobrenadante y
agregar 2 ml de Sol. De
transformación fría
Añadir 500 µl de
glicerol
Mezclar
suavemente
Mantener en baño
de hielo

74. Solución de transformación
CaCl2 100 mM
MgCl2 5 mM
Tris-HCl 5 mM pH 7.5
Función:
• El complejo de Calcio-Polibetahidroxibutirato cambia la
permeabilidad de la membrana y facilita la adsorcion del DNA
sobre la superficie celular.

75. C. Transformación con los plásmidos pCR2.1-TOPO (no recombinante) y
pCR2.1-TOPO-ape (recombinante).

76. D. Restricción de DNA de los plasmidos pCR2.1-TOPO y pCR2.1-TOPO-ape.

77. E. Separación electroforética de DNA de los plasmidos pCR2.1-
TOPO y pCR2.1-TOPO-ape restringidos con las enzimas Bam HI y
Eco R I
b. Desarrollo de la electroforesis.

79. Referencias.
• Luque J., Herráez Á. Biología molecular e ingeniería genética. Texto ilustrado. Elsevier.
Madrid. 2001.
• A. Allison lizabeth, fundamental molecular biology, blackwell publishig, USA, 2007, p.C.
181-197
• B. D. Hames, N. M. Hooper, biochemistry, BIOS, 2° edición, reino unido, 2000, p.C.
174-176
• Alberts, bray, hopkin, johnson, lewis, raff, roberts, walter. Introducción a la biología
celular, editorial panamericana, 2da edición. P. C. 195-197, 204.
• Pierce. Genética un enfoque conceptual,, editorial panamericana, 3ra edición, p.C. 1-
10, 451.
• Páncreas.Consultado: 8 de noviembre de 217. Disponible en:
http://biologiass2.Blogspot.Mx/2012/04/mecanismo-de-accion-de-las-hormonas-
en_29.Html.