Caracterización fenotípica y física de DNA recombinante

2. Antecedentes.
Ingeniería Genética: Es un conjunto de técnicas que
se emplean para introducir DNA foráneo a una
célula, y de esta manera lograr que se replique y/o
exprese.

3. 5. Pruebas
para
clonación del
gen
3

6. Vectores: molécula acarreadora para la
transferencia de genes en la recombinación
del DNA.
Tipos de vectores.
Vectores de
expresión.
Tiene algunas de
las características
de los vectores de
clonación.
Debe ser capaz de
transcribirse y
traducirse.
Vectores de
clonación.
Son empleados para
insertar el ADN exógeno y
amplificarlo.

7. Características de los vectores.
 Deben ser capaces de replicarse.
 Debe haber manera de introducirlo en la
célula.
 Debe ser detectada su presencia.
 Presenta sitios de unión únicos para
una o mas enzimas de restricción.

8. Vehículos de Clonación.
 Contiene un origen de replicación.
 Presenta marcadores de selección.

9. Vehículos de clonación.

10. Vehículos de expresión.

11. Otros vectores
Fásmidos Construido a partir de DNA
plasmídico y DNA fagico este ultimo
en pequeñas cantidades
Cósmidos Los cósmidos son unos vectores
híbridos entre un plásmido, que
proporciona la resistencia a los
antibióticos, y una región del ADN de
un bacteriófago llamada "cos" que le
otorga sus particulares características.
Fagémidos Construido a partir de DNA de fago y
DNA plasmidico este ultimo en
pequeñas cantidades.
BAC’S Cromosomas artificiales de bacteria.
YAC’S Cromosomas artificiales de levadura.
Vectores dobles. Construido a partir de DNA eucariotico
y procariotico.

12. Enzimas de restricción.
Son endonucleasas que reconocen
secuencias especificas dentro de las
cadenas de DNA, hidrolizan los enlaces
fosfodiéster y son las principales
herramientas de las técnicas de DNA
recombinante.

13. Cortes de las enzimas de
restricción

14. Obtención
del DNA
recombinante.
En este paso, el vector que se va a
utilizar y el DNA de interés son tratados
con una enzima de restricción y unidos
por medio de una DNA ligasa.

15. Operón Lac

16. Detección de las clonas recombinantes.
 Alfa complementación
 Inactivación insercional.
 Resistencia a antibióticos.
 Evidenciar la expresión del gen aislado.

17. Alfa complementación
 El gen LacZ codifica un polipéptido de
1029 aminoácidos.
 este tetrámero es una enzima funcional.
 Esta Polimerización depende de la
presencia de 50 primeros aminoácidos
 La supresión de los 50 primeros
aminoácidos genera un péptido (el péptido
de Omega) que es incapaz a polimerizar y
no muestra la actividad enzimática.

19. IPTG: Isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido

20. X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-
indolil-β-D-galactopiranósido

21. Inactivacion insercional
 es la
inactivación de
un gen dado
por
inserciones en
una secuencia
de DNA.

22. Métodos de introducción de
DNA en la célula.
Transfección Es el empleo de vectores de tipo vírico, que por su vía
natural de infección introducen en la célula huésped su
DNA, en este caso recombinante.
Microinyección Consiste en la introducción del DNA en la célula con una
microinyección.
Electroporación Se utiliza un impulso eléctrico para introducir el DNA a las
células bacterianas.
Lipoinfección El DNA se incorpora a liposomas y se fusiona a la membrana
celular con facilidad.

23. Transformación: Transferencia
de material genético desnudo
hacia una célula competente.

24. Inducción artificial de la
competencia.
 Estado de la célula que es inducida por
procedimientos en el laboratorio, en
donde las células son convertidas en
permeables de forma pasiva, a través
de diversas condiciones que
normalmente no ocurren en la
naturaleza

26. Enzimas
 Las endonucleasas:
 son enzimas cuya función es reconocer
y cortar el ADN extraño que puede
haber infectado la célula bacteriana.
 las ENDONUCLEASAS DEL TIPO II se
consideran los mejores instrumentos
para la tecnología del ADN
recombinante.

27. fosfatasas
 es una enzima que cataliza la
eliminación de grupos fosfatos de
algunos sustratos, dando lugar a la
liberación de una molécula de
ion fosfato y la aparición de un grupo
hidroxilo en el lugar en el que se
encontraba esterificado el grupo fosfato.

28. RNAsas
Son enzimas que cataliza
la hidrólisis de ARN en componentes más
pequeños. Pueden dividirse
en endonucleasas y exonucleasas

29. endonucleasas
 son enzimas que catalizan la ruptura
de enlaces fosfodiéster en diferentes
regiones ubicadas en el interior de una
cadena polinucleotídica

30. exonucleasas
 catalizan la escisión de enlaces
fosfodiéster en los extremos de las
cadenas

31.  electroforesis Es una técnica de separación de
moléculas, basada en la migración diferencial de especies
cargadas al ser sometidas a un campo eléctrico.
La migración también
depende del tamaño de
la molécula y a su vez
depende de la resolución
con que se requiera y
dependerá de la
concentración de fase fija

32. Características del DNA lineal
circular y superenrollado

33. Western blot
 las proteínas son separadas en primer lugar mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y posteriormente se transfieren a una
membrana, mediante la aplicación de un campo
eléctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez
completada esta operación la proteínas de interés son
reveladas por el agregado de un anticuerpo específico.

34. Radioinmunoensayo

35. Fig. Curva estándar de Radioinmunoensayo.

36. 36

37. Objetivos
 Sintetizar químicamente el gen de la
somatostatina y lograr que este se
exprese en células de E. coli.
 Emplear algunas de las técnicas de
DNA recombinante para crear células de
E. coli transformadas mediante la
inserción de vectores plasmídicos.
 Obtener somatostantina biológicamente
activa a partir de extractos de E coli.

38. Somatostatina
 Es un Tetradecapéptido.
 Producido en los islotes de langherhans
en el páncreas.
 Fue encontrado en extractos
hipotalámicos de ovinos.
 Inhibe la secreción de insulina, glucagón
y de la hormona del crecimiento.

39. Consideraciones.

40. ¿Por que somatostatina?
 Secuencia conocida
 Sensibilidad a ensayos biologicos y
radioinmunoensayos.
 Tamaño pequeño.
 Es de alto interes biologico.

41. 41
Esquema del plan de Trabajo.

42. 42
Método del triéster modificado.

43. Análisis en gel de
poliacrilamida.

44. Construcción del plásmido

52. 52

53. 53

54. 54

55. 55

56. .

58. 58

59. Objetivos
 Obtener DNA de doble cadena delos
plásmidos recombinante y no
recombinante derivados del pCR2.1-
TOPO.
 Obtener células competentes de E. coli
y transformarlas.
 Diferenciar un vector recombinante de
uno no recombinante por pruebas
fenotípicas y de restricción.

60. Medios de cultivo
Agar luria (L)
• Triptona (10g)
• Extracto de levadura
(5g)
• NaCl (10g)
• Agua (1L)
• Agar (1.5%)
Agar luria con ampicilina
(L-Ap)
• Triptona (10g)
• NaCl (10g)
• Agua (1L)
• Agar (1.5%)
• Extracto de levadura (5g)
• Ampicilina (50µg/mL)
Caldo luria (L)
• Triptona (10g)
• Extracto de levadura
(5g)
• NaCl (10g)
• Agua (1L)

61. Cepas.
Cepa Genotipo
Bacteriana
E. coli DH10B
transformada con el
plásmido pCR2.1-TOPO.
(Cultivo A)
E. coli DH10B
transformada con el
plásmido pCR2.1-TOPO-
ape.
(Cultivo B)
Plásmidos
pCR2.1-TOPO
pCR2.1-TOPO-ape

62. A. Obtención del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO
recombinante y no recombinante utilizando la técnica de
lisis alcalina.
10mL medio
L-Ap
Cultivo A
Repetir con el
Cultivo B
A 37°C
durante toda la noche
1.5mL de cultivo
A B
2 minutos
A B
Resuspender con
100µL
Sol. I BD

63. A B
200µL
Sol. II BD
5 veces
Incubar en hielo
5minutos
A B150µL
Sol. III
BD
10 segundos
Incubar en hielo
5minutos
5 minutos
Sobrenadant
e
A B
Aprox. 400µL
Fenol:Cloroformo:Alcoh
ol isoamílico 10 minutos
Sobrenadant
e

64. EtOH
absoluto
5min. en frío
DNA pp 5 minutos
1mL EtOH
70%
Centifugar 2min.
Decantar y volver a
centrifugar
Decantar
Secar
30µL TE pH
8
B. Obtención de células competentes de la cepa E. coli
DH10B
3mL medio
L-ApE. coli DH10B
37°C con agitación
durante toda la noche

65. 100mL medio
L
500µL
cultivo
37°C con
agitación
2-4hrs
10 minutos 10 minutos
25mL Sol. de
transformación
estérilIncubar en hielo
30 minutos<
Resuspender
con 2mL Sol.
de
transformació
n
500 µL
glicerol estéril
Conservar
a -70°C
30 µL

66. C. Transformación con los plásmidos pCR2.1-TOPO (no
recombinante) y pCR2.1-TOPO-ape (recombinante).
**ESTERILIDAD**
Agregar el DNA a los tubos que contienen las células competentes
Tubo 1 2 3 4 5
DNA pCR2.1-TOPO (µL) - 3 5 - -
DNA pCR2.1-TOPO-ape (µL) - - - 3 5
20-30 minutos
Colocar tubos
a 42°C durante
45 segundos
1 minuto 300 µL caldo L
37°C con agitación
45-60 minutos

67. 20µL Amp (100mg/mL) +
20µL de Sol. X-gal
(20mg/mL)
50µL de células
*NOTA: Las células
del tubo 1 también
se siembran en
Medio L
Dejar absorber e
incubar a 37°C
durante 24hrs
Contar colonias
transformantes
D. Restricción del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO y
pCR2.1-TOPO-ape.
Tubo 1 2 3 4 5 6
DNA pCR2.1-TOPO (µL) 5 5 5 - - -
DNA pCR2.1-TOPO-ape
(µL)
- - - 5 5 5
Regulador (µL) 1 1 1 1 1 1
BamHI(1U/µL) (µL) 1 - - 1 - -
EcoRI (1U/µL) (µL) - 1 - - 1 -
𝐇 𝟐 𝐎 (µL) 3 3 4 3 3 4

68. Incubar a
37°C
durante
2hrs
Mantener en
refrigeración hasta su
uso
E. Separación electroforética del DNA de los plásmidos
pCR2.1-TOPO y pCR2.1-TOPO-ape restringidos con las
enzimas BamHI y EcoRI.
PREPARACIÓN DEL GEL
AGAROSA
25mL Sol.
TAE
0.25g de agarosa
Fundir en baño
maría 5min. o 1-
2min en
microondas
Dejar
solidificar 20
min.

69. Llenar la cámara con
TAE 0.5cm sobre la
superficie del gel
Muestras del punto D
Incubar 20min
a 37°C
Preparar el marcador
de tamaño molecular
- +
3µL RNAsa
3µL
regulador de
carga
Aplicar 100V
durante 40min
Sumergir 20 min en TAE con
0.5µg/mL de bromuro de
etidio
Determinar distancia
de migración (cm)

70. Graficar el Log del tamaño
molecular del DNA de λ contra la
distancia de migración de los
mismos
Interpolar los valores
de migración para
determinar su
tamaño
Analizar y
concluir

71. http://apuntesbiologiamol.blogspot.mx/201
4_04_01_archive.html
http://apuntesbiotecnologiageneral.blogspo
t.mx/2015/02/vectores-de-transformacion-
genetica.html
REFERENCIAS: