Este documento resume varias técnicas moleculares utilizadas para diagnosticar enfermedades bacterianas, incluyendo PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis, dot blot/Southern blot para detectar exotoxinas bacterianas, y describe factores de virulencia bacterianos como pilis, toxinas y enzimas que promueven la invasión y daño de tejidos.

1. Aplicación de la biología molecular al
diagnóstico de enfermedades
transmitidas por bacterias
Dra. Patricia Saravia, Ph.D
Departamento de Bioquímica
Facultad de CCQQ y Farmacia
USAC

2. Pseudomonas
Helicobacter
BACTERIA
Staphylococcus

3. Bacterial classification
based on Gram
staining

4. WHICH ARE THE
VIRULENCE FACTORS?
ins
tox Flagellum
ins
ox NS
T
XI
TO
Cell wall/outer
Plasmid
membrane (if present)
Capsule
Pili

5. I. TOOLS FOR ADHESION
AND SPREAD
Pili/fimbriae
Other colonization factors (less well defined
proteins on cell surface)
Exoenzymes promote spread of bacteria in tissues
(hyaluronidase, collagenase, streptokinase, DNase)

6. II. TOOLS FOR INVASION
Invasins induce cellular uptake of bacteria
Factors promoting intracellular survival
- in phagocytes
- in epithelial cells
Transcytosis across epithelia

7. STAPHYLOCOCCAL CELL WALL STRUCTURE

8. III. TOOLS TO DESTROY
CELLS AND TISSUES
Exotoxins/enzymes
1. Hemolysins/cytolysins Induce cell membrane damage
2. Enterotoxins Intestinal effects (diarrhoea)
3. Neurotoxins Affect nervous system
4. Cytotoxins Kill cells by effects other than
membrane damage
5. Superantigenic toxins Overstimulate immune system
Non-toxic exoenzymes Hyaluronidase, Collagenase,
Lipase
Endotoxin

9. Acido Desoxiribonucleico (ADN)
Generalidades
• Almacena y transmite la
información genética
• A simple vista, la estructura
del ADN de un humano es
igual a la de una bacteria
• Está formado por bases
nitrogenadas, grupos
fosfato y una pentosa
(desoxiribosa)

10. Superenrollamiento del ADN

11. Secuencia nucleotídica
Molécula de Desoxiribosa
fosfato Bases
Puentes de
Hidrógeno
Estructura de azúcar-fosfato

12. Diagnóstico de Mycobacterium
tuberculosis utilizando la técnica
de PCR (polymerase chain
reaction)
Licda. Maria Eugenia Castellanos
Tesis de graduación, 2005

13. MYCOBACTERIAL CELL WALL STRUCTURE

14. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

15. PCR HEMIANIDADO
IS6110
Primers externos
Pt8
Pt9
Primers internos
TB290
Pt9
www.icampus.ucl.ac.be/. ../PCR/PCR.html

17. DETECCION DEL PRODUCTO DE
AMPLIFICACION
94ºC = Desnaturalización
65ºC = Hibridación
72ºC = Extensión
www.pitt.edu/ ~heh1/PCR.jpg

18. DETECCION DEL PRODUCTO DE
AMPLIFICACION
Electroforesis en gel de
agarosa al 2% en muestras
de esputo (por duplicado)
mostrando producto
amplificado (337 pb).
310 pb
Pozo 1= H20
Pozo 2 = Control Neg.
ADN humano
Línea 5 = Control Pos.
M. tuberculosis
A2 y A9= Positivas

19. Detección de genes que codifican por
exotoxinas bacterianas utilizando la técnica
de dot blot ó Southern blot
Guanina
Adenina
Citosina
Timina

20. Enterotoxins
MODE OF ACTION OF CHOLERA TOXIN (CT)
an ADP-ribosyltransferase

21. Sondas de ADN/ARN
ADN de cadena doble (duplex)
Desnaturalización
Sonda marcada
(ADN o ARN)
ADN de cadena simple
Hibridación a
secuencias
complementarias en
ADN

22. Dot blot

23. Southern blot

24. Gracias por su
atención !!!