1. Andrea Bonelli
Neiry Briceño

2. Enzimas de restricción.
o Cortan las cadenas de ADN en sitios específicos.
o Son enzimas defensivas, protegen el ADN de los
huéspedes bacterianos de otros mo extraños.

3. Enzimas de restricción.
 Reciben su nombre a partir de la bacteria de la cual
fueron aisladas. Ejemplo: EcoRI
 Cada enzima puede reconocer y separar una secuencia
especifica de ADN de tira doble de 4 a 7 pb.
 Los cortes de ADN pueden producir extremos romos o
extremos adherentes o cohesivos.
Los extremos adherentes son muy útiles a la hora de construir
moléculas hibridas de ADN.

4. Enzimas de restricción.
 Frecuencia con la que una enzima escindirá una molécula
de ADN: 4 (nºde pb`s).
 Importancia:
Poseen gran especificidad de reconocimiento de una secuencia
corta de ADN dúplex y la subsiguiente hidrólisis de un enlace
fosfodiester en cada hebra. Los fragmentos originados son útiles
para iniciar la clonación celular o acelular y la creación de mapas
de restricción.

5. Tipos de enzimas de
restricción.
Endonucleasas de restricción Tipo I Tipo II Tipo III
Endonucleasa y metilasa en Endonucleasa y metilasa en una
Endonucleasa (metilasa en una
Actividad enzimática una misma proteína (distintas misma proteína (distintas
proteína independiente)
subunidades) subunidades)
Coenzimas o cosustratos ATP, Mg2, S-adenosilmetionina Mg2 ATP, Mg2, S-adenosilmetionina
3 subunidades:
2 subunidades:
S reconocimiento 1 subunidad, aunque actúa como
Estructura proteica MS reconocimiento y metilación
R restricción homodìmero
R restricción
M metilación
No palindròmico, 2 partes
Sitio de reconocimiento Palindròmico No palindromico
separadas
Corta las 2 hebras en puntos Corta las 2 hebras en puntos Corta las 2 hebras en puntos
cercanos entre sí, poco equivalentes, muy específicos, distintos entre sí, situados a 24-
Punto de corte
específicos, a unos 1000 pb del dentro de la secuencia de 26 pb del sitio de
sitio de reconocimiento reconocimiento reconocimiento
Adenia o citosina muy específicas
Dentro de la secuencia de Adenina dentro de la secuencia
dentro de la secuencia de
Punto de metilación reconocimiento. En ambas de reconocimiento. En una sola
reconocimiento. En ambas
hebras hebra
hebras
Ejemplos Eco k, Eco B Numerosos Eco PI, Eco P15

7. Papel biológico de sistema
metilación- restricción.
 Por cada enzima de restricción, una metilasa reconoce
la misma secuencia que forma parte del sistema de
restricción y une de manera covalente grupos metilo a
bases de esa secuencia.

8. Papel biológico de sistema
metilación- restricción.
 El ADN de la bacteria se metila de forma especifica.
 La metilación impide la unión de la enzima de
restricción (El ADN no es hidrolizado).
 Al entrar en la célula ADN de otro organismo, este
ADN puede ser degradado por la ER.
 Las nucleasas restringen la posibilidad de infección
por virus.

9. Papel biológico de sistema
metilación- restricción.
 Si 1 sola hebra de ADN esta metilada, la ER no
reconoce el sitio. La metilasa añade el grupo metilo a la
otra hebra.
 Afecta principalmente a citosinas y adeninas.
 Las metilasas utilizan como donador a S-
adenosilmetionina.
 Este mecanismo regula la expresión génica, en
eucariotas.

10. Acción de las enzimas de
restricción de tipo II.
 Funcionan a manera de tijeras para el corte del ADN. El
sitio de restricción es también el lugar de
reconocimiento e hidrólisis.
 Se hidrolizan enlaces fosfoèster del ADN, uno en cada
hebra, generando 2 segmentos de restricción. Quedan
fragmentos 3’OH y 5’P.

11. ADN ligasas.
 Los fragmentos generados con una misma restrictasa a
partir de ADN’s distintos se aparean por medio de sus
extremos cohesivos a partir de ADN ligasas.
 Las ligasas forman el enlace fosfodiester que falta,
consumiendo energía.

12. Proceso general para la clonación
de genes
 Comprende siete pasos:
 Preparación del inserto de ADN.
 Preparación del vector de clonación.
 Formación de la molécula de ADN recombinante.
 Incorporación del ADN recombinante a la célula
anfitriona.
 Propagación del cultivo.
 Detección y selección de los clones recombinantes.
 Expresión génica.

13. 1.-Preparacion del inserto de ADN
 Lisis de células,(suspensión o centrifugación).
 Se eliminan proteínas, enzimas o fragmentos
proteolíticos y se precipita y se concentra el ADN.
 Se fragmenta con endonucleasas de restricción.
 Los fragmentos son aislados:
 ADN vírico o de un plásmido, electroforesis en gel de agarosa.
 ADN genómico, un fragmento de ADN marcado con 32P, llamado
sonda, se une con el inserto.

14. 2.- Preparación del vector para la clonación
 Las características de la molécula de ADN para el
vector:
 Pequeña.
 Con una secuencia de ADN y mapa de restricción
reconocible.
 De fácil introducción a la célula anfitriona.
 Con capacidad de replicación autónoma.
 Que posea varios sitios de restricción
 Que incluya un gen marcador (resistente a un
antibiotico)

15.  El vector puede provenir de una célula eucariota o
procariota (bacteriófagos, plásmidos, quimeras…)
 Se fracciona con las mismas enzimas de restricción del
inserto ADN

16. 3.- Formación del ADN recombinante
 Unión in vitro del ADN de restricción y el vector, con el
uso de ligasas:
 Une extremos cohesivos
 Une extremos romos con menor afinidad
 Las asociaciones pueden ser:
 Intramoleculares: baja concentración de ADN
 Intermoleculares: se forma el ADNr, vector+vector o
inserto+inserto.

18. 4.- Incorporación del ADNr a la célula
anfitriona
 Para incorporar el ADNr a la célula se necesitan ciertos
métodos:
 Físicos y químicos
 Pasivos
 Activos: uso de vectores víricos o aplicación de descargas
eléctricas.
-El inserto puede permanecer unido al vector o
recombinarse con el ADN cromosomico

19. 5.-Propagacion del cultivo
 La división de las células en el cultivo junto con la de
su genoma, producirá la formación de copias de ADNr
incorporados…Clonación.
 Estas células se colocan en un medio liquido donde
forman poblaciones con copias de la célula original
(clones celulares)

20. 6.- Detección y sección de los
clones recombinantes
 A través de la clonación se obtienen varias colonias y
para seleccionar la necesaria se usan 3 tipos de
métodos:
 Métodos de hibridación: uso de una sonda marcada.
 Métodos inmunoquímicos: uso de anticuerpo especifico.
 Métodos genéticos o selección fenotípico: genes
marcadores

21. 7.- Expresión génica
 Se necesitan vectores de expresión, que incluyen un
promotor
 Región reguladora de transcripción
 Debe ser inducible, que se active bajo alguna
circunstancia experimental controlable (adición de
algún nutriente).