Este documento presenta una introducción a la ingeniería genética. Explica objetivos de aprendizaje, vocabulario clave, y técnicas como endonucleasas de restricción, electroforesis y reacción en cadena de polimerasa. También describe los pasos para crear quimeras mediante la recombinación de DNA, incluyendo la extracción de genes, uso de vectores, y expresión genética en cultivos de hospederos.

1. Ingeniería Genética-I.G. Microbiología General- Biol 3705 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

2. Objetivos Al terminar de discutir este capítulo, el estudiante estará capacitado para: Mencionar vocabulario de ingeniería genética (biotecnología, clonación, otras) Denominar técnicas de ingeniería genética como: endonucleasas de restricción, transcriptasa inversa, electroforesis, sondas de DNA, etc. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

3. Objetivos Distinguirá las etapas de la recombinación del DNA, hacer una quimera Explicará la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) Mencionará algunos productos obtenidos a través de rDNA Distinguirá metodología para realizar cultivos transgénicos, plantas y animales Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

4. Introducción- I.G. Ingeniería genética -manipulación y modificación genoma organismos Biotecnología - desarrollo productos industriales usando organismos para nuestro beneficio Aplicacion tecnológica que usa sist. Biológicos, para hacer o modificar productos o procesos para uso específico DNA se aisla, maneja, y modifica Secuenciar DNA- orden de bases Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

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6. Introducción- I.G. rDNA - DNA recombinado, insertar genes en célula, modificando genéticamente organismos clonar - insertar y propagar DNA, requiere vectores especiales Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

7. Steps in Cloning a Gene Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.1

8. Herramientas y Téc. De I.G. Características DNA Sube temp. de 90-95C se desnaturaliza, si enfria temp. vuelven a unirse las bandas por enlaces de H DNA se corta con endonucleasas de restricción Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

9. Extraccion de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

10. Extracción de DNA Cultivo Sonido/bolitas vidrio Vortex + fenol +calor- romper paredes y/o capsida; + detergente- remover membrana Proteasas-precipitar proteínas + sales Agitar mezcla con cloroformo y fenol- DNA en medio de 2 fases DNA precipitarlo con etanol frío (insoluble en alcohol) Pellet DNA lavarlo con alcohol frío Secar y colocar en buffer Confirmar presencia en electroforesis Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

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12. Endonucleasas de Restricción Enzimas reconocen y cortan secciones palindrómicas (4-5-6-7 pares) Se nombran por la 1a letra del género - bacteria aislada, 1as. 2 letras de la especie y núm. De endonucleasa EcoR1- G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G usado para cortar DNA en pequeñas porciones usado para remover e insertar en DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

13. Restriction Endonucleases and Their Recognition Sequences Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Table 14.2

14. Enzima de Restricción Enzima de restricción Bam HI Se obtiene de Bacillus amyloliquefaciens Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

15. Endonucleasas de Restricción No cortan DNA de donde provienen- está modificado por adición de grupos metilo (CH 3 ) Cortan en “cohesive ends” o “sticky ends”- parean entre sí ej. DNA cortado con EcoR1 siempre producirá los mismos “sticky ends” permite ‘sticky ends” se junten ( enlaces H) al enfriar temp. no importa de donde provengan Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

16. Endonucleasas Restricción Hay cortes que no son “sticky ends”. Se llaman “blunt ends” y es menos eficiente Ej. C-C-C G-G-G Proceso de ligación es menos eficiente que con “sticky ends” Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

17. Eco R1 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

18. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.3

19. Enzima de Restricción Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

20. Otras Enzimas- I.G. Ligasas - sellan pedazos cortados previamente por endonucleasas, sellan genes en plásmido y cromosomas Transcriptasa inversa- usada convertir RNA en DNA; copias hechas con esta enzima se denominan- cDNA (“complimentary”)- permite sintesís DNA de r,m,t RNA sin introns (eucariotas), descubierta en 1970 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

21. Synthesis of cDNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.4

22. Recombinant DNA molecules Jackson, Symons, and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

23. Recombinant plasmid construction Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.5

24. Análisis DNA- Electroforesis Proceso verificación cortes DNA sean los correctos Electroforesis -muestras cortadas colocarlas en gel (agarosa) y se expone a campo eléctrico DNA carga -, se moverá al área + partículas más peq. se moverán más rápido visualiza con bromuro de etidio y luz uv Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

25. Electroforesis Bandas se ven con bromuro de etidio y luz UV Estándares permiten saber los cortes y tamaño de ellos Permite decidir si 2 muestras son idénticas Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

26. Gel Electrophoresis used to separate molecules based on their charge and size agarose or acrylamide gels can be used to separate DNA fragments DNA is acidic; it migrates from the negative to the positive end of the gel each fragment’s migration rate is inversely proportional to the log of its molecular weight Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

27. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

28. Electroforesis Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

29. Hibridización Acidos Nucleicos y Sondas (“Probes”) Banda de DNA puede hibridizarse con otra- permite detectar secuencias específicas de nucleótidos de muestras desconocidas Areas de hibridización se pueden visualizar por: Marcadores radiactivos Isótopos- emiten radiación Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

30. Sondas de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

31. Sondas de DNA DNA probe - a length of single-stranded DNA that matches part of the gene and is linked to a radioactive atom. The single-stranded probe seeks and binds to the gene. Radioactive signals from the probe are then made visible on x-ray film, showing where the probe and gene matched. Previous page: What does a predictive gene test tell you? TOC page: Table of Contents Next page: What is the current status of predictive gene testing for cancer? Know of a great site to add to this list? Earth & Space Biology Biotechnology Botany Computers & Technology Conferences & Opportunities Environment Genetics Mathematics Microbiology Microscopy Reference Debates & Ethics Science Ed. Resources Science News Teacher Pages Virology Virtual Field Trips Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

32. “ Southern Blot” Método donde se fragmenta DNA y separa por electroforesis, se desnaturaliza (1 hebra) e inmobiliza en un papel de filtro. Una sonda se incuba con la muestra y si halla áreas complementarias se hibridizará Uso de sondas usadas diagnosticar infecciones e identificación de microorg. Hay kits comerciales para identificación de bacterias y virus Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

33. Southern blotting technique developed by Edwin M. Southern (1975) used to detect specific DNA fragments often uses radioactive DNA hybridization probes autoradiography method for detecting radioactively labeled molecules Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

34. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

35. Southern Blotting Technique Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.6

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37. Métodos de Recombinación DNA rDNA- DNA recombinado, se conoce desde 1970 Se crean clones: Remover el gen seleccionado de X organismo (donante), cortado con endonucleasas y aislado Propagación en un hospedero diferente Gen insertado a un vector (plásmido o virus) Insertar en hospedero de clonación (bacteria o levadura) Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

38. Características Vectores Clonación Llevar DNA donado Aceptar hospedero de clonación Plásmidos excelentes , pequeños, fácil de manejar- pueden transferirse por transformación Bacteriófagos- buenos vectores, inyectan DNA a hospedro bacteriano por transducción Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

39. Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA there are four types of cloning vectors plasmids (most commonly used) phages and viruses cosmids artificial chromosomes Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

40. Cosmids do not exist in nature these vectors have been constructed to contain features from both phages and plasmids they have a selectable marker, multiple cloning sites from plasmids and a cos site from  phage Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

41. Artificial Chromosomes used when large fragments of DNA must be cloned bacterial artificial chromosomes (BACs) played important role in the human genome project Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

42. Caract. Vectores Clonación Vectores tienen información de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina); lo que ayuda a usar medios selectivos y los clones recombinados sean evidentes Hospedero de clonación deberá crecer rápido, usar medios de cultivo ordinarios, genoma conocido como E.coli , Saccharomyces , Bacillus subtilis Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

43. Vector de Clonación - Plásmido Vector de clonación pBR322 – plásmido Contiene genes de resistencia a antibióticos : Ampicilina Tetraciclina Tamaño DNA = menos de 5 kb (4,363 nucleótidos) Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

44. Plasmido pBR322 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

45. Bacteriofago Lambda Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

46. Construction of a Recombinant Plasmid Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.13

47. Reacción de Polimerasa en Cadena- PCR Técnica bien sensitiva, puede detectar una sola célula cancerosa Necesita materiales: “ primers”- oligonucleótidos 15-30 bases DNA polimerasa- Taq polimeras (Thermus aquaticus) Máquina realiza ciclos: desnaturaliza a 94C, priming-enfriar de 50 (A=T), 65C (G=C)- 3 enlaces H, extensión- 72C Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

48. The Polymerase Chain Reaction (PCR) enables the rapid synthesis of many copies of a specific DNA fragment from a complex mixture of DNA and other cellular components reaction mix contains primers target DNA thermostable DNA polymerase such as Taq polymerase each of the four deoxyribonucleotide triphosphates thermocycler is the instrument used Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

49. PCR En 20 ciclos se producen 1 millón de copias, máquina puede hacer 20 ciclos en 2-3 horas desnaturalizar “ priming” extensión Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

50. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

51. Quimera Quimera – inserción en hospedero de clonación y expresión genética Ejemplo – Construcción Quimera 1. Se aisla gen interferón humano (500 pb y codifica proteina de 166 amino ácidos). Se corta con endonucleasa Hind III 2. Se abre el plásmido (vector de clonación) con Hind III Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

52. Quimera – cont. 3. Permite que lados “sticky ends” de (1) y de (2) se junten por complementaridad. Enzima ligasa sellará uniones = quimera 4. Quimera se introduce por transformación en hospedero de clonación E. coli 5. Cultivo de E. coli con quimera se coloca en medio de cultivo con ampicilina; solo crecerá E. coli que tenga el plásmido ( lleva gen de R-amp). Se seleccionan colonias de la placa petri. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

53. Quimera – cont. 6. Se cultivan colonias de E. coli transformadas 7. Se coloca (6) en medio de cultivo especial- condiciones óptimas que permita expresión del gen interferón humano por su transcripción y traducción; se sintetiza la proteina y la libera al medio de cultivo 8. Procesamiento final – purificación proteina y remoción del microorg. 9. Así se han sintetizado hormonas, enzimas, etc. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

54. Inserting Recombinant DNA into Host Cells most common hosts E. coli - procaryotic host S.cerevisiae – eucaryotic host hosts are engineered to lack restriction enzymes and rec A DNA introduction into microbes transformation electroporation Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

55. Inserting Recombinant DNA into Eucaryotic Host Cells electroporation microinjection gene gun Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens (used to introduce foreign DNA into plant genomes) Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

56. Expression of Foreign Genes in Host Cells cloned genes, in the new host cell, are called heterologous genes ,and may not be expressed unless they are modified recombinant gene must have a promoter that host RNA polymerase recognizes introduced eucaryotic genes must be modified to have a procaryotic leader sequence and all introns must be removed expression vectors are used to overcome problems with expression of recombinant genes in host cells Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

57. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

58. Verificacion Cultivo Clonado Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

59. Construction of Genomic Libraries used when gene of interest is on a chromosome that has not been sequenced the library is constructed by cleaving the genome and then cloning the fragments into vectors the libraries are screened for the genes of interest in a variety of ways Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

60. III. Productos Bioquímicos de Tecnología de DNA Recombinante Tecnología DNA recombinante usada por compañias farmaceúticas – manufacturar medicinas contra: diabetis y enanismo Antes se usaba insulina porcina y bovina para los diabéticos, aunque podia ocasionar reacciones alérgicas Enanismo se trataba con hormona de crecimiento (HGH) extraída de cadáveres Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

61. The Numerous Applications of Genetic Engineering in medicine many useful proteins gene therapy in agriculture use of genetic engineers allows for the direct transfer of desirable traits to agriculturally important animals and plants Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

62. Insulina rDNA Insulina recombinada Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

63. Productos de Tec. rDNA Hoy se produce insulina y HGH por rDNA. También se elaboran vacunas. Otros productos Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

64. Organismos Genéticamente Modificados - GMO’s Transfección – proceso de introducir genes extraños a un organismo Transgénico – organismo modificado genéticamente (GMO’s) Pseudomonas fluorescens – se añadió 1 gen de Bacillus thuringiensis que codifica para la producción de un insecticida- proteina Liberación de GMO’s regulado por EPA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

65. GMO’s GMO’s pueden realizar bioremediación ( degradación de sustratos contaminantes como hidrocarburos, benceno, otros) Plantas: Uso Agrobacterium tumefaciens – transfiere fragmento de su DNA a planta y la recombina; tiene plásmido- usarlo como vector de clonación para alterar la planta Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

66. Bioengineering of Plants Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.19

67. GMO’s Animales: Genes extraños se insertan al óvulo usando alto voltaje o microinyección Se han logrado ratones transgénicos con enfermedades de alzheimer, fibrosis cística, etc. Usando animales transgénicos se ha logrado: sintetizar factores de coagulación de humanos; sustancia disuelve coágulos sanguíneos Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

68. Terapia Genética Sustituir genes defectuosos por genes funcionales usando vectores de clonación. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

69. Terapia Genetica Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

70. Social Impact of Recombinant DNA technology there is scientific and philosophical concern about the use of embryonic stem cells in gene therapy. This is currently a major controversial issue in the U.S. the production of genetically engineered food the possibility of the production of genetically engineered organisms by bioterrorists and other issues Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

71. Referencias www.slic2.wsu.edu:82/.../pages/Chap10.html Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla

72. Biotecnología en Bacterias José Morey Misraim Vélez

73. Producción de vacuna recombinante

74. Producción de vacuna recombinante

75. Producción de vacuna recombinante

76. Ventajas Desarrollo de productos médicos Antibióticos Vacunas Hormonas Productos dificiles de obtener, en grandes cantidades

77. Conclusión Los microorganismos son máquinas flexibles y fascinantes capaces de producir un vasta variedad de compuestos útiles. Podemos esperar ver muy pronto la utilización de estos en la bioremediación y la producción de nuevos metabolitos, compuestos de bioconversiones y expresión de nuevas proteínas; Nos espera un futuro brillante en la biotecnología de microorganismos.